鈣黏蛋白和基質金屬蛋白酶-2在非小細胞肺癌中的表達及其與血管生成擬態的關系

武世伍 承澤農 俞 嵐 宋文慶 陶儀聲 (蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科，安徽 蚌埠 233000)

鈣黏蛋白和基質金屬蛋白酶-2在非小細胞肺癌中的表達及其與血管生成擬態的關系

武世伍1承澤農1俞 嵐1宋文慶1陶儀聲1(蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科，安徽 蚌埠 233000)

目的 探討在非小細胞肺癌(NSCLC)中E-鈣黏蛋白(E-cad)和基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達及其與血管生成擬態(VM)的關系。方法 采用免疫組化ElivisionTMplus法和特殊組織化學法檢測160例NSCLC和20例正常肺組織中E-cad、MMP-2的表達水平和VM情況。結果 在正常肺組織中E-cad、MMP-2的表達率和VM分別為100%、25.0%和0%，在NSCLC組織中分別為45.6%、66.3%和36.9%，差異顯著(P＜0.01);其水平與腫瘤細胞分化程度、淋巴結轉移、臨床分期和術后生存期有關(均P＜0.01);E-cad的表達水平與MMP-2的表達水平及VM呈負相關，MMP-2的表達水平與VM呈正相關(均P＜0.01)。Kaplan-Meier生存分析表明MMP-2的過表達和VM均與患者的生存率有關，陽性患者生存率明顯低于陰性者(P＜0.01);而E-cad陽性表達的患者生存率明顯高于陰性者(P＜0.01)。多因素分析：PTNM分期、淋巴結轉移、E-cad和MMP-2的表達以及VM是影響NSCLC根治術后患者預后的獨立因素(P＜0.01)。結論 E-cad、MMP-2在NSCLC組織中的表達水平以及VM與腫瘤的分化程度、轉移和預后等均有關，E-cad、MMP-2和VM聯合檢測對NSCLC的進展及預后判斷有重要意義。

非小細胞肺癌;E-cad;MMP-2;VM;預后

血管生成擬態(VM)的存在與疾病進展和預后不良相關〔1〕。鈣連蛋白是一種跨膜糖蛋白家族，介導同種細胞間、細胞與基質之間的黏附反應，維持正常上皮細胞形態、細胞極性及組織結構完整性〔2〕，其中上皮鈣黏蛋白(E-cad)是鈣連蛋白中的重要成員，當其表達水平降低時，就會引起細胞間黏附功能喪失，從而導致腫瘤發生浸潤、轉移。當腫瘤細胞從原發腫瘤分離脫落后，必須穿透原發腫瘤及其間質的基底膜。正常基底膜是由Ⅳ型膠原等成分構成，基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)是降解Ⅳ型膠原最主要的酶之一，當其表達水平增高時，可促使腫瘤細胞的侵襲及轉移灶的形成。本研究探討E-cad、MMP-2的表達和VM與NSCLC侵襲、轉移及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集我科2003年1月至2005年4月存檔石蠟包埋NSCLC組織標本160例(術前未行放、化療)和正常肺組織標本20例，所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2010年4月，隨訪時間為3～84個月，其中男130例，女30例;年齡26～82〔平均(59.6±9.5)〕歲，≥60歲86例，＜60歲74例。從大體類型看，中央型120例，周圍型40例;鱗癌116例(高分化17例，中分化71例，低分化28例)，腺癌44例(高分化4例，中分化32例，低分化8例)。腫瘤長徑D≥3.0 cm 145例，D＜3.0 cm 15例;按淋巴結有無轉移，有轉移76例，無轉移84例。根據UICC2002版PTNM病理分期標準進行分期，其中Ⅰ期患者31例，Ⅱ期患者43例，Ⅲ期患者34例，Ⅳ期患者52例。對照組正常肺組織20例取自肺癌腫塊＞5.0 cm的肺組織，病理HE染色證實。

1.2 試劑 鼠抗人E-cad單克隆抗體(產品編號：MAB-0589，克隆號：4A2C7)、鼠抗人MMP-2單克隆抗體(產品編號：MAB-0244，克隆號：75-7F7)、鼠抗人CD34單克隆抗體(產品編號：MAB-0034，克隆號 QBEnd/10)、ElivisionTMplus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司。PAS染色液為蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科配制。

1.3 方法

1.3.1 采用免疫組織化學ElivisionTMplus法 將石蠟標本以4 μm厚連續切片，烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進行。采用已知陽性片作對照，以PBS液代替一抗作空白對照。

1.3.2 CD34和PAS套染 CD34染色，DAB顯色后，流水沖洗1 min終止顯色反應，PAS染色按照《臨床技術操作規范-病理學分冊》說明進行。

1.4 結果判定 CD34和E-cad均以細胞膜和細胞質出現棕黃色顆粒為陽性;MMP-2蛋白以細胞質有棕黃色細顆粒為陽性。采取二次計分法：每例標本隨機計數5個高倍視野(×400)，計數每個高倍視野中陽性細胞所占百分比并計分。首先將染色強度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽性細胞百分比計分，0分為陰性，1分為陽性細胞為＜10%，2分為11% ～50%，3分為51% ～75%，4分為＞75%。用染色強度得分和細胞數得分的乘積作為判斷表達結果，若積分≤1為陰性，＞1為陽性。免疫組化結果由高年資病理醫師讀片評定。

1.5 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較用Log-rank檢驗，多因素分析采用 Cox回歸多因素模型，在 NSCLC組織中，E-cad、MMP-2的表達和VM與正常肺組織、各臨床及病理因素的相關性采用χ2和Spearman等級相關檢驗。

2 結果

2.1 NSCLC中存在VM HE染色光鏡下可見由腫瘤細胞圍成的管道樣結構，無內皮細胞襯覆，管腔內不見壞死的腫瘤細胞及炎癥細胞。經CD34與PAS雙重染色，管腔呈現CD34陰性但PAS陽性的結構，即VM，見圖1。除外，還能見到網絡狀的VM。160例NSCLC標本中，36.9%(59/160)可見由 CD34陰性的腫瘤細胞圍成的管道樣或網絡狀的結構，而PAS陽性，一層PAS陽性物質將腫瘤細胞和管腔分開。正常肺組織中未見有VM現象。

2.2 NSCLC中的VM與臨床病理的關系 VM陽性與患者的性別、年齡、組織學類型等之間差異無統計學意義(P＞0.05)。隨著NSCLC的分化越差，VM的陽性越強，差異有顯著性(P＜0.01)，PTNM分期Ⅰ～Ⅱ期VM陽性率為4.1%(3/74)，Ⅲ～Ⅳ期VM陽性率為65.1%(56/86)，VM組的PTNM分期與無VM組的PTNM分期相比差異有統計學意義(P＜0.01)，且VM組的患者更易發生淋巴結轉移(P＜0.01)，見表1。

2.3 NSCLC中E-cad的表達及其與臨床病理的關系 E-cad主要定位于NSCLC癌細胞膜和胞質，呈棕黃色。正常肺組織中E-cad陽性顆粒主要位于細胞質和膜。在NSCLC中，E-cad的陽性率為45.6%(見圖1)，較正常肺組織的表達率(20/20)明顯減少(P＜0.01)。E-cad的表達與患者性別、年齡及組織學類型無相關性(P＞0.05)。隨著NSCLC的分化越差，E-cad的表達越低(P＜0.01);E-cad的陽性表達與淋巴結轉移有關(P＜0.01);Ⅰ～Ⅱ期腫瘤中E-cad的陽性率為77.0%(57/74)，Ⅲ～Ⅳ期腫瘤中E-cad的陽性率為18.6%(16/86)，兩者差異顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 VM、E-cad和MMP-2陽性表達與NSCLC臨床病理關系(n)

2.4 NSCLC中MMP-2的表達及其與臨床病理的關系

MMP-2主要表達于NSCLC癌細胞質，棕黃色，在胞膜中也有表達。對照組中也定位于胞質和膜，在NSCLC中MMP-2蛋白陽性表達率為66.3%(見圖1)，較對照組的表達率(5/20)顯著升高(P＜0.01)，其表達水平與NSCLC的分化程度、淋巴結轉移及臨床分期有關，即隨著MMP2表達越高，腫瘤的分化越差、臨床分期越晚、更易發生淋巴結轉移。見表1。

2.5 NSCLC中E-cad、MMP-2的表達和VM情況以及它們的關系 在VM陽性組的病例中，E-cad陽性率為5.1%(3/59);在E-cad陽性表達的病例中，VM的陰性率為95.9%(70/73)，差異有統計學意義。Spearman相關分析顯示，E-cad在NSCLC中的表達與 VM呈負相關(r=-0.622，P＜0.01)。E-cad與MMP-2的表達呈負相關(r=-0.593，P＜0.01)。MMP-2的表達與VM 呈正相關(r=0.463，P＜0.01)。

2.6 多因素分析 將病理組織分化，年齡、PTNM分期、腫瘤直徑、腫瘤位置、淋巴結轉移、性別、VM、E-cad和MMP-2表達等因素引入Cox模型進行多因素分析，結果顯示：E-cad與MMP-2的表達和 VM、PTNM分期以及淋巴結轉移是影響NSCLC患者預后的獨立因素。見表2。

2.7 生存分析 本組病例總的5年生存率為26.9%。VM陽性組與陰性組5年生存率分別為1.7%(1/59)和41.6%(42/101)，差異有統計學意義(P＜0.01);E-cad陽性組與陰性組5年生存率分別為52.1%(38/73)和5.7%(5/87)，差異有顯著性(P＜0.01);MMP-2陽性組與陰性組5年生存率分別為6.6%(7/106)和66.7%(36/54)，差異有顯著性(P＜0.01)。

圖1 VM、E-cad和MMP-2在NSCLC中的陽性染色(ElivisionTM，×400)

表2 160例NSCLC患者多因素分析

3 討論

在卵巢癌、乳腺癌、腎癌、原發性膽囊癌、肝癌以及雙分化腫瘤〔3～7〕中等相繼報道有VM的存在。VM結構直接由腫瘤細胞圍成，腫瘤細胞與血流之間僅有一層PAS陽性的基底膜樣物相隔，無血管內皮細胞屏障，因此在腫瘤細胞釋放的蛋白水解酶以及血流的沖擊作用下，腫瘤細胞更容易穿透基底膜樣物而直接進入血液，從而促進腫瘤的侵襲和轉移。因此，VM的存在與腫瘤的轉移和預后不良密切相關〔1，3〕。并且，新近研究表明：能夠形成VM結構的腫瘤細胞具有某些干細胞特性，具有多向分化的能力〔8〕。本研究證實NSCLC中有VM的存在，具有VM結構的區域很少出現壞死和炎細胞，同時發現VM的檢出率與腫瘤細胞分化程度、腫瘤轉移與否及臨床分期等密切相關。

E-cad表達異常可導致細胞正常黏附功能喪失或腫瘤細胞脫離原發病灶向其他部位轉移〔9〕。本研究結果顯示，在NSCLC中，隨著腫瘤的進展，即隨著腫瘤的分化越差、臨床分期越晚和發生淋巴結轉移，E-cad的表達率顯著降低。且E-cad的表達與VM呈負相關，E-cad表達的減少，不僅使細胞間附著變得松散，也使得細胞內骨架缺失相鄰細胞黏附而形成的固定作用，從而獲得自身變形并形成腔隙的能力〔10〕，促進VM的形成。

因此MMP-2在腫瘤細胞突破基底膜屏障而浸潤轉移中起重要作用。MMP-2主要由腫瘤細胞、成纖維細胞和炎細胞分泌。本研究發現MMP-2蛋白在腫瘤組織中的表達水平比在正常組織中明顯升高，差異有顯著性;并且隨著腫瘤分化越差、臨床分期越晚，其表達水平也顯著升高;在伴有淋巴結轉移的腫瘤中其表達水平也較沒有淋巴結轉移的腫瘤顯著升高，與文獻報道一致。且MMP-2的表達VM呈正相關，提示MMP-2可能在惡性腫瘤細胞血管生成擬態中起著重要作用〔11〕。

本結果提示VM和MMP-2陽性組的NSCLC患者的生存時間比較短，比其陰性組預后差，這與文獻報道一致〔3，12〕。E-cad陽性表達組的生存時間顯著高于陰性表達組，這與其他學者研究結果相同〔13〕。

本研究提示E-cad蛋白的表達與VM、MMP-2陽性率可能存在一定聯系。隨著腫瘤的快速進展，腫瘤細胞分泌MMP-2的能力增強，與ECM相互作用，使細胞外蛋白水解、重塑形成可以輸送血液的微循環管道結構即VM;而此時E-cad表達降低導致腫瘤細胞彼此之間附著變得松散，黏附力降低，移動性增強，并且獲得自身變形能力而促進VM形成;而能夠形成VM結構的腫瘤細胞與管腔僅間隔一層PAS陽性物質，此時黏附力降低的腫瘤細胞在MMP-2降解基底膜樣物以及血流的沖擊雙重作用下，很容易脫離原發灶而發生淋巴結轉移甚至遠處轉移。

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13 Falkenback D，Nilbert M，Oberg S，et al.Prognostic value of cell adhesion in esophageal adenocarcinomas〔J〕.Dis Esophagus，2008;21(2)：97-102.

Expressions of E-cad and MMP-2in non-small cell lung cancer and their relationship to vasculogenic mimicry

WU Shi-Wu，CHENG Ze-Nong，YU Lan，et al.
Department of Pathology，Bengbu Medical College，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，Anhui，China

Objective To explore whether vasculogenic mimicry(VM)exists in non-small cell lung cancer(NSCLC)or not and elucidate its relationship to the expressions of E-cad or MMP-2.Methods Expressions of E-cad，MMP-2 and VM were examined by immunohistochemistry and histochemistry containing from 160 cases of NSCLC and 20 cases of normal lung tissue.Results The positive rates of E-cad and MMP-2，and VM in normal lung tissue were 100%，25.0%and 0%respectively and in NSCLC were 45.6%，66.3%and 36.9%.There were significant differences between normal lung and NSCLC tissues(P ＜0.01).The expressions of E-cad，MMP-2 and VM were significantly related with tumor differentiation，lymph node metastasis，clinical stage，postoperative survival time(all P ＜0.01).There was a negative correlation between expressions of E-cad and MMP-2.There was a negative correlation between expressions of E-cad and VM.And there was a positive relationship between VM and the expression of MMP-2.VM and overexpression of MMP2 were related poor prognosis：the survival rates were significantly lower in positive patients than those of negative patients(both P＜0.01);while the survival rate of the E-cad-positive was higher than that of E-cad-negative patients(P ＜0.01).PTNM stage，lymph node metastasis，positive expressions of E-cad and MMP-2 and VM were independent prognostic factors of NSCLC(P＜0.01).Conclusions VM and the expressions of E-cad and MMP-2 are related to differentiation，lymph node metastasis，clinical stage and prognosis of NSCLC.The combined detection of E-cad，MMP-2 and VM has an important role in predicting the progression and prognosis of NSCLC.

NSCLC;E-cad;MMP-2;VM;prognosis

R734.2

A

1005-9202(2012)17-3623-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.003

安徽省高等學校優秀青年人才基金項目(No.2012SQRL095)

1 蚌埠醫學院病理學教研室

陶儀聲(1965-)，女，教授，主要從事腫瘤病理研究。

武世伍(1977-)，男，碩士，講師，主要從事肺癌病理研究。

〔2011-06-16收稿 2011-09-16修回〕

(編輯 聶素濱)