艾炷灸、電針對D-半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織c-fos mRNA的影響

韋良玉 趙利華 王進(jìn)聲 姚 平 陳 煌 (廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸科，廣西 南寧 530023)

艾炷灸、電針對D-半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦組織c-fos mRNA的影響

韋良玉 趙利華 王進(jìn)聲 姚 平 陳 煌 (廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸科，廣西 南寧 530023)

目的 觀察艾炷灸、電針對D-半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)腦區(qū)c-fos mRNA的影響。方法 健康3月齡昆明雄性小鼠體重(30±2)g72只，水迷宮檢測后按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計分為:生理組、造模組、艾灸1、2組、電針組、尼莫地平組組，每組12只。造模組、艾灸1、2組、電針組、尼莫地平組，連續(xù)42 d頸背部皮下注射D-半乳糖造成小鼠衰老模型;生理鹽水組連續(xù)42 d頸背部皮下注射等量生理鹽水，12 d后艾灸1、2組，分別選取“足三里、懸鐘”，“關(guān)元、百會”行艾柱灸治療，電針組選取“足三里、懸鐘”，尼莫地平組給予尼莫地平灌胃，均為隔日/次，共15次。采用水迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶、原位雜交檢測各組小鼠大腦皮層、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA的表達(dá)。結(jié)果 模型組潛伏期較生理組、艾灸1、2組、尼莫地平組延長(P＜0.01或P＜0.05)，模型組原象比、垮臺次數(shù)較其他各組縮短、降低(P＜0.01或P＜0.05)，模型組小鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA表達(dá)的神經(jīng)元密度較生理組、艾炷灸、尼莫地平灌胃治療組降低(P＜0.01)。結(jié)論 艾炷灸“足三里、懸鐘”，“關(guān)元、百會”穴位處方可能通過提高D-半乳糖衰老小鼠腦組織大腦皮層、海馬CA3區(qū)c-fosmRNA的表達(dá)改善學(xué)習(xí)記憶能力。

艾炷灸;D-半乳糖;學(xué)習(xí)記憶能力;海馬CA3;基因表達(dá)

近年來衰老基因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，即刻早期基因c-fos在腦中參與神經(jīng)元的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與凋亡過程，與認(rèn)知功能和記憶有關(guān)，記憶的形成與即刻早期基因(IEGS)啟動了細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)，最后引起突觸重塑有關(guān)〔1〕。學(xué)習(xí)記憶的分子基礎(chǔ)長時程增強(qiáng)(LTP)的誘導(dǎo)也伴有c-fos基因表達(dá)增強(qiáng)，因而，認(rèn)為c-fos基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)合成是LTP能夠維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的物質(zhì)基礎(chǔ)，所以，人們將c-fos基因作為學(xué)習(xí)記憶功能的客觀指標(biāo)之一，在對學(xué)習(xí)記憶的研究中備受關(guān)注〔2〕。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦為髓海，增齡等引起的腦衰老則為髓海失養(yǎng):“髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥(《靈樞·海論》)。”“高年無記性者，腦髓漸空也”(《醫(yī)林改錯》)。歷代醫(yī)家都重視艾炷灸的養(yǎng)生保健作用，故有“保健灸”、“長壽灸”之說。本研究觀察艾炷灸對D-半乳糖衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)腦區(qū)c-fos mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康3月齡昆明雄性小鼠體重(30±2)g 72只。均由廣西醫(yī)科大學(xué)動物中心SPF實(shí)驗(yàn)室提供(動物許可證號:SCXK桂2003-0003)。精制艾絨為蘇州東方艾絨廠提供。主要儀器:Morris水迷宮系統(tǒng)(MWM，北京中科院生理所生產(chǎn));奧林巴斯生物顯微攝影系統(tǒng)(BX60 PM20型，日本);Matic Images Advanced 3.2病理圖文分析系統(tǒng)(Motic China Group Co.，Ltd.)。專用試劑:D-半乳糖為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;尼莫地平片為山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供;c-fosmRNA試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2 動物分組 按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計將72只小鼠分為:生理組、造模組、艾灸1、2組、電針組、尼莫地平組，每組各12只。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 參照文獻(xiàn)〔3〕用D-半乳糖頸背部皮下注射，建立亞急性衰老小鼠模型。造模組、艾灸1、2組、尼莫地平組每天以 D-半乳糖按120 mg·kg－1·d－1頸背部皮下注射，連續(xù)42 d，同時對生理組頸背部皮下注射等量生理鹽水42 d。

1.3.2 治療方法 造模第13天開始治療，艾灸1組選取小鼠“足三里、懸鐘”，艾灸2組選用“百會、關(guān)元”進(jìn)行艾柱灸治療，時間選擇上午9:00-11:30，選取小鼠雙側(cè)“足三里”(先灸)、“懸鐘”(后灸)，及“百會”(先灸)、“關(guān)元”(后灸)，灸后用棉簽輕輕按壓穴位。三壯/穴/次。定位取穴按照胡元亮〔4〕《實(shí)驗(yàn)動物針灸手冊》，“足三里”在膝關(guān)節(jié)下方，腓骨小頭下3 mm處的肌溝中;“懸鐘”在后肢外踝尖直上5 mm腓骨后緣處，“百會”在頂骨正中處，“關(guān)元”臍下正中線1 cm處。穴位選定后剪毛，施灸時涂凡士林以保護(hù)小鼠皮膚且便于固定艾炷，艾炷做得緊而結(jié)實(shí)(底座直徑2 mm，高度5 mm，重量約13～15 mg)，用線香點(diǎn)燃，每壯時間約18～20 s，當(dāng)小鼠掙扎時更換艾炷。電針組將輸出電流正極接足三里穴，負(fù)極接懸鐘穴，用20 Hz連續(xù)波，電流0.24～0.30 mA，以小鼠肢體輕微抖動，不嘶叫為度，每次3 min。尼莫地平灌胃組劑量按體表面積等效折算計算法，予12 mg·kg－1·d－1，灌胃。治療方法均為隔日 1次，共 15次。生理組和造模組不做任何治療性干預(yù)，但給予與各治療組同樣時間、同等程度的捉抓。

1.4 樣本制備 再次Morris水迷宮結(jié)束后，將小鼠斷頭處死，于冰浴上取大腦，于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。所有組織蠟塊4 μm連續(xù)切片4張置60℃烤箱烤干。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 Morris水迷宮行為測試實(shí)驗(yàn) (1)定位航行實(shí)驗(yàn):共進(jìn)行5 d。MWM實(shí)驗(yàn)的第2天至第6天，進(jìn)行定位航行試驗(yàn)。平臺位于第三象限，沒于水下1 cm，小鼠入水點(diǎn)為各象限(分為1、2、3、4象限)池壁中點(diǎn)，每天分上下午兩個時間段，每一個時間段每鼠訓(xùn)練4次，且每鼠每次訓(xùn)練間隔時間不能低于1 min。訓(xùn)練期間迷宮外參照物(包括實(shí)驗(yàn)者)及環(huán)境保持不變，訓(xùn)練每天在上午9:00～下午6:00進(jìn)行，訓(xùn)練時將小鼠面向池壁(背向平臺)由四個入水點(diǎn)放入水池中，測其60 s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(小鼠找到平臺并滯留其上5 s為成功進(jìn)駐)所需時間(即逃避潛伏期)。如在60 s內(nèi)小鼠不能成功進(jìn)駐平臺，則實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺并令其停留10 s，記錄逃避潛伏期為60 s。潛伏期能綜合反映出小鼠的學(xué)習(xí)、記憶及運(yùn)動行為能力，其值越小，說明小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力越強(qiáng)。(2)空間探索試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)第7天，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn):撤除平臺，從1象限(原平臺象限對側(cè))池壁中點(diǎn)將小鼠放入水中，電腦記錄2 min內(nèi)小鼠在原平臺象限的游泳時間和游泳軌跡。原平臺象比(原象比)越大，跨越平臺次數(shù)(跨臺次數(shù))越多，說明小鼠學(xué)習(xí)、記憶及行為能力越強(qiáng)。兩指標(biāo)可綜合反映出小鼠在平臺撤除后所發(fā)生的探索反應(yīng)，從而綜合評判小鼠的學(xué)習(xí)、記憶及行為能力。

1.5.2 c-fos mRNA原位雜交檢測 原位雜交試劑盒采用特異性針對c-fos的寡核苷酸探針，經(jīng)地高辛標(biāo)記。針對小鼠c-fos靶基因的mRNA序列為:(1)5'-TCCTT CTCCA GCATC GGCTC GCCTG TCAAC-3'，(2)5'-CTTCT ATGCA GCAGA CTGGG AGCCT CTGCA-3'，(3)5'-CTTAC ACGTC TTCCT TCGTC TTCAC CTACC-3'。原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行。陰性對照，除不加探針雜交液外，其余步驟相同。

原位雜交陽性信號以細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性的神經(jīng)元，采用Matic Images Advanced 3.2病理圖文分析系統(tǒng)，在高倍(10×40)顯微鏡視野下于每張病理切片皮層部位、海馬CA3區(qū)，分別選取不相重疊連續(xù)的10、6個視野，計數(shù)完整陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，其與視域參考面積(3 292.76、1 975.66 m2)的比值(單位面積神經(jīng)元數(shù))即是陽性神經(jīng)元表達(dá)密度。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)前定位航行、空間探索試驗(yàn)指標(biāo) 表1造模前，各試驗(yàn)組在定位航行、空間探索試驗(yàn)指標(biāo)在差異不顯著，提示在造模治療前五組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力一致，無差別。

表1 造模前水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)(±s，n=12)

表1 造模前水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)(±s，n=12)

組別 定位航行原象比空間探索跨越次數(shù)(次/min) 潛伏期(s)模型組33.16±16.49 0.85±0.00 0.13±0.12生理組 32.39±16.07 0.85±0.00 0.12±0.12艾灸2組 39.19±17.82 0.85±0.00 0.12±0.08艾灸1組 36.33±16.04 0.85±0.00 0.19±0.13電針組 34.40±18.40 0.85±0.00 0.19±0.16尼莫地平組38.03±17.20 0.85±0.00 0.13±0.10

2.2 實(shí)驗(yàn)后在定位航行、空間探索試驗(yàn)指標(biāo) 表2結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)后，在定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)中五個實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過重復(fù)測量數(shù)據(jù)資料分析及多個樣本均數(shù)的方差分析:五組間比較差異具有顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)。其中:(1)模型組“潛伏期”較生理組、艾灸1、2組、尼莫地平組延長(P＜0.01)，模型組“原象比”、“垮臺次數(shù)”較其他各組縮短、降低(P＜0.01或P＜0.05)，(2)其余四組，尼莫地平組與生理組比較在潛伏期差異有顯著性意義(P＜0.05)。其余各指標(biāo)在4組間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

表2 造模治療后水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)(±s)

表2 造模治療后水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與生理組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別n定位航行原象比空間探索跨越次數(shù)(次/min) 潛伏期(s)模型組12 40.89±20.43 0.86±0.04 0.19±0.10生理組 10 25.14±17.892)1.02±0.092)0.36±0.112)艾灸2組 11 29.18±18.252)1±0.102)0.35±0.132)艾灸1組 10 31.14±19.742)3)0.99±0.132)0.35±0.132)電針組 12 31.31±18.652)4)0.99±0.122)0.33±0.141)尼莫地平組 11 33.58±19.002)4)1±0.141)2)0.31±0.181)

2.3 小鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA的表達(dá) 各實(shí)驗(yàn)動物組大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)均有c-fos mRNA的表達(dá)，模型組大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA的表達(dá)細(xì)胞較少、染色淺，而生理組和各干預(yù)治療組大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA的表達(dá)細(xì)胞明顯增多、染色較深，各組大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA表達(dá)差異顯著(P＜0.01)。模型組大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA陽性表達(dá)神經(jīng)元密度較其他五組降低(P＜0.01，P＜0.05)，其他五組在大腦皮質(zhì)c-fos mRNA陽性表達(dá)神經(jīng)元密度無差別;尼莫定平組海馬CA3區(qū)c-fos mRNA陽性表達(dá)神經(jīng)元密度與艾灸1組比較差異顯著(P＜0.05)。其余4組間海馬CA3區(qū)c-fos mRNA陽性表達(dá)神經(jīng)元密度無差異。各組大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA的陽性表達(dá)神經(jīng)元密度見表3。

表3 大腦皮質(zhì)、海馬CA3 c-fos mRNA陽性神經(jīng)元表達(dá)密度(±s，個/m2)

表3 大腦皮質(zhì)、海馬CA3 c-fos mRNA陽性神經(jīng)元表達(dá)密度(±s，個/m2)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與艾灸1組比較:3)P＜0.05

組別n大腦皮質(zhì) 海馬CA3模型組12 36.64±10.42 42.32±10.30生理組 10 48.12±3.51 58.41±6.022)艾灸2組 11 48.23±6.802)59.73±4.132)艾灸1組 10 47.13±5.052)54.16±4.952)電針組 12 46.63±3.031)54.87±3.462)尼莫地平組 11 44.59±2.811)52.14±2.241)3)

圖1 光鏡下各組大腦皮質(zhì)、海馬CA3區(qū)c-fos mRNA的表達(dá)(×40)

3 討論

D-半乳糖造成衰老模型是因代謝過程中機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，引起腦神經(jīng)元的退行性變化而表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降〔5，6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示通過艾炷灸和電針足三里、懸鐘穴，艾炷灸百會、關(guān)元穴，尼莫地平灌胃治療均能抑制D-半乳糖引起的腦功能損害，保護(hù)D-半乳糖衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。無論在正常老化還是老年性癡呆，其病理改變主要見于海馬和大腦皮質(zhì)，其中海馬又是最易受衰老影響的腦區(qū)之一〔7〕。海馬CA3區(qū)被認(rèn)為與空間辨別性學(xué)習(xí)記憶活動的關(guān)系尤為密切〔8〕。即刻早期基因c-fos是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因，研究顯示可能由于衰老神經(jīng)元接受刺激的反應(yīng)性減低所致，同樣學(xué)習(xí)訓(xùn)練，青年組大鼠與成年、老年大鼠在海馬區(qū)的c-fos的表達(dá)有顯著差異〔9〕。以往研究顯示D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠的擬腦老化效應(yīng)也表現(xiàn)有神經(jīng)元細(xì)胞 c-fos mRNA水平的下降〔10〕，而耳針腦、腎穴〔11〕可以促進(jìn)AD大鼠模型海馬CA1區(qū)c-fos mRNA的表達(dá)，并與學(xué)習(xí)記憶呈正相關(guān)。本研究提示艾炷灸、電針、尼莫地平灌胃治療從基因轉(zhuǎn)錄水平影響與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白的c-fos表達(dá)，從而改善大腦的學(xué)習(xí)記憶功能，延緩腦衰老。

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〔2011-06-03收稿 2011-10-11修回〕

(編輯 曹夢園)

Effect of moxa cone moxibustion on learning and memory function and expression of c-fos mRNA in cerebral tissue of the senile mice induced by D-galactose

WEI Liang-Yu，ZHAO Li-Hua，WANG Jin-Sheng，et al.
The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning 530023，Guangxi，China

Objective To observe the influence of moxa cone moxibustion on learning and memory function and expression of c-fos protein in the related cerebral tissue with the memory function in senile mice induced by D-galactose injection.Methods 60 male mice(3 months old)were randomly and equally divided into the normal sodium control，model，moxa cone moxibustion 1(acupoint ST36 and GB39)，moxa cone moxibustion 2(acupoint DU20 and RN4)，nimodipine medicated groups.Rats in treatment and model groups were given with D-galactose injection for 42 days，while rats were injected the same dosage of normal sodium in the normal sodium control.12 days later，rats in three treatment groups were treated for every other day for one month.Spatial learning and memory were measured and observed with the Morris water maze(MWM)computer system and expression of c-fos protein in the cerebral cortex and hippocampal(CA3)of the senile mice was detected by immunohistochemical method.Results Significant difference was observed between the model and the other four groups in spatial learning and memory function，the escape latency of model group was prolonged，the spanning(original)platform frequency，the percentage of(original)platform quadrant were decreased(P＜0.01，P＜0.05).The neuronal density expression of c-fos protein in the cerebral cortex and hippocampal(CA3)in the model group were decreased compared with other groups(P＜0.01).Conclusions The moxa cone moxibustion prescription on ST36 and GB39，DU20 and RN4 can improve the learning and memory function of the senile mice induced by D-galactose，which may be related to the increasing expression of c-fos protein in the cerebral cortex and hippocampal(CA3).

Moxa cone moxibustion;Learning and memory function;D-galactose;Cortex;Hippocampus CA3;Gene expression

R245

A

1005-9202(2012)17-3702-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.042

廣西自然科學(xué)基金(桂科自0832170)

趙利華(1967-)，女，博士，教授，主要從事針灸防治老年病學(xué)方面研究。

韋良玉(1958-)，女，主任醫(yī)師，主要從事針灸防治老年病學(xué)方面的研究。