破血化瘀，填精補髓法對實驗性腦出血大鼠血腫周圍組織腦源性神經生長因子及TrkB蛋白表達的影響

任吉祥 林 雪任洪亮趙建軍 王 健 (長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 3002)

破血化瘀，填精補髓法對實驗性腦出血大鼠血腫周圍組織腦源性神經生長因子及TrkB蛋白表達的影響

任吉祥 林 雪1任洪亮1趙建軍 王 健 (長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130021)

目的 探討破血化瘀，填精補髓法對腦出血大鼠血腫周圍組織腦源性神經營養因子(BDNF)及其受體表達的影響。方法 應用Wistar大鼠復制腦出血大鼠模型，觀察破血化瘀，填精補髓法方劑改善腦出血大鼠神經功能缺損的情況及對血腫周圍組織BDNF及其受體酪氨酸激酶B(TrkB)蛋白表達水平的影響。結果 在給藥第7天，與模型組比較，陽性藥組、受試藥各劑量組均明顯增加了損傷腦區BDNF陽性細胞數量(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05);在給藥第3、7、14天，與模型組比較，受試藥高劑量和中劑量均明顯增加了損傷腦區TrkB陽性細胞數量(P＜0.05或P＜0.01)。結論 破血化瘀，填精補髓法方劑能明顯改善腦出血大鼠神經功能缺損;其作用機制可能與上調腦出血血腫周圍損傷組織中BDNF及受體TrkB蛋白表達有關。

腦出血;BDNF;TrkB;破血化瘀;填精補髓

腦損傷后的康復依靠腦的自身可塑性及功能重組，這些機制有多種表現方式，如神經營養因子及神經生長因子的增殖、突觸功能的調節、細胞凋亡的抑制等。近年來，腦源性神經生長因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶B(TrkB)在腦損傷修復中的作用已被肯定。國內關于BDNF及TrkB的研究較多，但研究對象多缺血性腦梗死，有關中藥治療腦出血(ICH)的研究在國內并不多見。本研究觀察破血化瘀，填精補髓法中藥湯劑對實驗性腦出血大鼠BDNF及TrkB表達的影響，探討中藥干預對腦出血后顱腦損傷的修復作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體重250～300 g，由吉林大學藥學院提供，大鼠許可證號:SCXK-(吉)2007-0003。破血化瘀，填精補髓法實驗方劑:(水蛭8 g、生大黃10 g、生蒲黃 15 g、虻蟲 5 g、瓜蔞 20 g、三七 10 g、石菖蒲 15 g、龜板膠10 g)，采用傳統煎藥方法，去渣后取藥液進行濃縮，使1 ml藥液中含生藥1 g，4℃保存備用。醒腦健神膠囊(批號:921116，吉林省中醫院制劑室)。BDNF及TrkB免疫組化試劑盒采用中杉金橋通用型二步法檢測試劑盒(Pv6000)。大鼠腦立體定位儀(美國STOELTING公司);手持式牙科鉆(上海齒科器械廠);光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);BMJ-1型生物組織包埋機(天津航空機電有限公司);RM2235型組織切片機(德國LEICA公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 150只Wistar大鼠隨機分成7組:正常對照組6只;假手術組，模型組，受試藥高、中、低劑量組，陽性藥對照組每組24只。又分為 1、3、7、14 d四個時間點，每時間點6只。

1.2.2 模型制備 參照張朋奇等〔1〕方法制造實驗性腦出血模型。實驗動物用10%水合氯醛(350 mg/kg體重)腹腔麻醉，于大鼠腹側尾根部1.5 cm處縱行切開，游離尾動脈，微量進樣器抽取非肝素化尾動脈血50 μl。調整腦立體定位儀，使大鼠俯臥位固定于立體定位儀，使前、后囟基本在同一水平面上〔2〕。沿正中線切開頭部皮膚暴露顱骨、前囟和冠狀縫。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為0點，于0點前0.4 mm、右側旁開3 mm處鉆孔，達硬腦膜表面。微量進樣器垂直刺入顱骨外表面下6.0 mm處將50 μl動脈血注入右側尾狀核。以10 μl/min的速度，5 min左右全部注入。留針30 min，緩慢出針1 mm，留針10 min，然后緩慢將針完全退出，骨蠟封住鉆孔。局部涂抹青霉素粉并縫合。假手術組操作過程同上，但不向腦內注血。

1.2.3 給藥方法 正常對照組:自由飲食飲水。假手術組:生理鹽水灌胃，1 ml/100 g，1次/d;模型組。同假手術組。治療低劑量組:0.5 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d;中劑量組:1 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d;高劑量組:2 ml/100 g湯藥灌胃，1次/d。陽性藥對照組:予醒腦健神膠囊30 mg/100 g體重，溶于2 ml水灌胃，1 次/d。

1.2.4 大鼠神經功能評分 采用Longa評分法。0分:沒有神經功能缺損;1分:左側前爪不能完全伸展;2分:行走時，大鼠向左側轉圈;3分:行走時，大鼠身體向左側(癱瘓側)傾倒;4分:不能自發行走，有意識喪失。

1.2.5 免疫組化檢測BDNF及TrkB蛋白表達水平 大鼠以水合氯醛麻醉后，切開胸腔，剝離心臟，止血鉗夾閉下腔靜脈和胸主動脈，剪開右心耳，靜脈留置針刺進左心室，用0.9%生理鹽水進行灌注，待流出清澈生理鹽水后，改用10%多聚甲醛灌注，待大鼠頸部及上肢僵硬后，斷頭取腦，腦組織沿針道前后5 mm切開，取中段部分。組織固定，梯度脫水，石蠟包埋，切片機切片。進行常規蘇木素-伊紅(HE)染色。根據Pv6000說明書進行免疫組織化學染色。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行分析，各組指標以±s表示，組間相差顯著性采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 BDNF免疫組織化學染色結果 在給藥第1、3天，與假手術組比較，模型組BDNF陽性細胞明顯增高(P＜0.01);與模型組比較，陽性藥醒腦健神膠囊對損傷腦區BDNF陽性細胞數量并沒有明顯的影響(P＞0.05);單因素方差分析表明受試藥劑量依賴性增加腦損傷時腦區BDNF陽性細胞數量，進一步分析表明受試藥高劑量和中劑量明顯增加了損傷腦區BDNF陽性細胞數量(P＜0.01，P＜0.05)。在給藥第7天，與模型組比較，陽性藥醒腦健神膠囊也明顯增加損傷腦區BDNF陽性細胞數量(P＜0.01)，受試藥高劑量、中劑量和低劑量均明顯增加了損傷腦區BDNF陽性細胞數量(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)。在給藥第14天，與假手術組比較，模型組BDNF陽性細胞明顯增高(P＜0.05)，但與第7天比較，BDNF陽性細胞明顯降低;與模型組比較，陽性藥醒腦健神膠囊對損傷腦區BDNF陽性細胞數量并沒有明顯的影響(P＞0.05);單因素方差分析表明受試藥劑量依賴性地增加了腦損傷時腦區BDNF陽性細胞數量，進一步分析表明受試藥高劑量和中劑量明顯增加了損傷腦區BDNF陽性細胞數量(P＜0.01，P＜0.05)，而低劑量組并沒有看到相同的效應。見圖1。

圖1 各組大鼠1、3、7、14 d BDNF細胞數目比較

2.2 TrkB免疫組織化學染色結果 給藥第1天，與假手術組比較，模型組TrkB陽性細胞明顯增高(P＜0.01)。與模型組比較，陽性藥醒腦健神膠囊對損傷腦區TRKB陽性細胞數量并沒有明顯的影響(P＞0.05);單因素方差分析表明受試藥劑量依賴性增加腦損傷時腦區TrkB陽性細胞數量;進一步分析表明，只有受試藥高劑量組明顯增加了損傷腦區TrkB陽性細胞數量(P＜0.05)。在給藥第3、7、14天，與模型組比較，陽性藥醒腦健神膠囊對損傷腦區TrkB陽性細胞數量仍沒有明顯的影響(P＞0.05);受試藥高劑量和中劑量明顯增加了損傷腦區TrkB陽性細胞數量(P＜0.05或P＜0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠1、3、7、14 d，TrkB細胞數目比較

3 討論

BDNF在中樞神經系統發育過程中具有不可替代的作用，能通過多種途徑調控不同種類神經元的生存、發育、分化，維持神經突觸傳遞〔3〕，調控神經元損傷后的存活、修復及細胞退行性變等，甚至在細胞凋亡過程中也起著關鍵作用〔4〕。神經營養因子通過與其特異性TrkB中的全長型受體結合，激活胞內的酪氨酸激酶活性，引導TrkB的自身磷酸化，激活鈣調蛋白激酶(CaMK)、絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酸肌醇-3-激酶(PI3K)三條途徑，并最終激活 cAMT反應元件結合蛋白(CREB)，起到抵抗自由基、拮抗氨基酸神經毒性、平衡細胞內Ca2+水平、抑制神經細胞凋亡〔5〕、促進血管內皮新生〔6〕等作用。本實驗結果表明，各組大鼠在腦出血后，通過應用破血化瘀，填精補髓法中藥干預，其神經功能缺失表現可有明顯改善;3 d后，高、中劑量組各種相關癥狀即可消失。破血化瘀，填精補髓法各組與模型組比較，BDNF的表達在第7天達高峰，14 d可恢復到基本水平。重復的單因素方差分析顯示，高劑量組效果最顯著;其對TrkB表達的促進作用，可在第7天達峰，持續到第14天，并與其藥物劑量呈正相關。

總之，運用破血化瘀，填精補髓法中藥湯劑治療腦出血大鼠可明顯減輕神經功能缺損的癥狀，其機制可能與破血化瘀，填精補髓法中藥湯劑顯著促進BDNF及TrkB表達，啟動BDNF-TrkB通路達到神經保護及修復作用有關。

1 張朋奇，朱賢立，趙甲山，等.一種大鼠腦內出血模型的建立與評價〔J〕.中國臨床神經外科雜志，2005;10(1):33-5.

2 諸葛啟釧譯.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.第3版.北京:人民衛生出版社，2005:17-25.

3 Takei N，Nawa H.Regulation of brain function by neurotrophin〔J〕.Chemistry，2007;76(1):111-23.

4 侯莉娟，喬德才.腦源性神經營養因子的研究現狀〔J〕.中國康復醫學雜志，2005;20(12):940-2.

5 劉 芳，張偉玲，鄒 偉，等.神經生長因子對急性神經損傷保護作用機制初探〔J〕.中國急救醫學，2006;26(10):687-8.

6 王雅丹，胡 豫，孫春艷.Akt、ERK1/2活化在腦源性神經營養因子促血管新生中的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2007;23(5):833-8.

〔2012-01-17收稿 2012-02-10修回〕

(編輯 袁左鳴)

R743

A

1005-9202(2012)17-3719-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.048

1 長春中醫藥大學

王 健(1970-)，男，主任醫師，博士，主要從事中醫內科腦病研究。

任吉祥(1977-)，男，博士，主治醫師，主要從事中醫內科腦病研究。