絲裂霉素C對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響

孫 奎 吳曉明 孫艷軍 張宏霞 王鶴鵬 楊景哲

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院燒傷整形外科，河北 承德 067000)

絲裂霉素C對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響

孫 奎 吳曉明 孫艷軍 張宏霞 王鶴鵬 楊景哲

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院燒傷整形外科，河北 承德 067000)

目的 探討絲裂霉素C(MMC)對瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFB)增殖的影響。方法 采用不同濃度的MMC作用于體外培養(yǎng)的FB，采用四唑鹽比色(MTT)方法，觀察MMC對體外培養(yǎng)的KFB增殖活性的影響。采用RT-PCR方法，檢測MMC對體外培養(yǎng)的KFB TGF-β1mRNA表達的影響。結(jié)果 MTT顯示在24、48、72 h時間段內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞生長抑制率呈現(xiàn)上升趨勢，作用48 h、72 hKFB與24 h相比KFB有極顯著差異(P＜0.01)，作用72 h與48 h相比，有上升趨勢，但差異比不顯著，24 h為最佳作用時間。RT-PCR方法顯示:MMC干預組TGF-β1mRNA相對表達量明顯低于正常對照組，從12.5 μg/mlMMC開始具有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，隨MMC濃度增大，MMC干預組TGF-β1mRNA相對表達量呈逐漸降低趨勢。結(jié)論 2.5～200 μg/ml范圍的MMC可有效抑制體外培養(yǎng)的病理性KFB的增殖活性，當濃度為200 μg/ml時作用尤為明顯，MMC對TGF-β1mRNA的表達具有明顯減弱效應。

瘢痕疙瘩;成纖維細胞;絲裂霉素C;增殖;轉(zhuǎn)化生長因子β

瘢痕疙瘩是皮膚損傷后組織異常修復的結(jié)果，瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFB)過度增殖及成纖維細胞過量合成膠原等細胞外基質(zhì)(ECM)為其特征。瘢痕疙瘩是當今整形外科領(lǐng)域的研究熱點和難點〔1〕。本文擬觀察絲裂霉素C(MMC)對KFB增殖的影響因素。

1 材料與方法

1.1 標本來源 標本分別取自承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院整形科13例因瘢痕疙瘩入院進行整形手術(shù)的患者:男9例、女4例，年齡55～64〔平均(59.6±3.4)〕歲。取材部位上肢5例。面部3例，軀干5例。選取病程短且生長活躍的瘢痕疙瘩組織，未接受任何抑制瘢痕增生的治療，均無系統(tǒng)性疾病史，且患者對所取組織用于實驗均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 KFB培養(yǎng)和實驗分組 將手術(shù)切下的瘢痕疙瘩組織均采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進行體外培養(yǎng)。在無菌條件下切除表皮及皮下脂肪，將標本制成1 mm3左右的組織塊，置于培養(yǎng)瓶中，在95%空氣、5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)8～12 h。然后加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液適量，繼續(xù)培養(yǎng)，3～4 d換液1次，2～3 w后，原代細胞生長成單層，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)KFB24 h后，吸去培養(yǎng)液和未貼壁細胞，更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，實驗分為正常對照組、MMC干預組，正常對照組用DMEM培養(yǎng)液;MMC干預組 MMC 的終濃度分別為 2.5、12.5、50、100、200 μg/ml。

1.2.2 MTT法測定KFB的增殖 取對數(shù)生長期的KFB，用2.5 g/L胰酶消化，調(diào)整細胞密度至2×104/ml，接種于3塊96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液和未貼壁細胞，根據(jù)分組不同更換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液，每孔加入各組溶液200 μl，每濃度復種8孔。標準環(huán)境下分別孵育24、48、72 h 后，向每孔內(nèi)加入 20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。倒置顯微鏡下觀察MTT結(jié)晶狀況，然后棄去孔內(nèi)上清液，每孔內(nèi)加入150 μl二甲基亞砜，搖床振蕩10 min后，在酶標儀下測定波長490 nm處的光密度值，設(shè)8個復孔，計算藥物作用于KFB的生長抑制率。抑制率=1－(藥物干預組A490值/空白對照組A490值)×100%，最后以時間為X軸，抑制率為Y軸繪制生長曲線，并獲得最佳培養(yǎng)時間。

1.2.3 檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)mRNA水平 將KFB按10 cm2/ml比例加入Trizol，用Trizol總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(日本導津UV2201型)測定總RNA濃度和純度，重復測定3次，A260和A280之比應在1.8～2.0，計算樣品總RNA濃度。引物序列為:TGF-β1cDNA擴增的上游引物為5'-ctg ctt cag ctc cac aga gaa ga-3'，下游引物為5'-aag ttg gcg tgg tag ccc tt-3'，產(chǎn)物片段長度為111 bp。取1 μg總 RNA，加入 Oligo(dT)18 Primer，70℃溫育 5 min;迅速放入冰浴中，加入10 mmol/L dNTP、RNA酶抑制劑、5×緩沖液，42℃溫育5 min;冰浴中加入5 U/μl苜蓿花葉病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水至總體積20 μl，42℃溫育60 min，70℃ 10 min，置冰上，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒎磻苤糜赑CR儀上，95℃預變性10 min后，95℃變性1 min，50℃退火30 s，共34次，最后72℃充分延伸10 min。反應完成后取10 μl PCR反應液，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用PCR Marker作分子量標準。電泳完畢后在紫外熒光數(shù)字成像儀下觀察結(jié)果。以每例TGF-β1與β-actin擴增產(chǎn)物條帶光密度的比值作為TGF-β1mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)資料以±s表示，進行方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 體外KFB的形態(tài)學觀察 體外KFB原代培養(yǎng)成功后，培養(yǎng)細胞呈梭形，細胞體積較大，胞質(zhì)向外伸出2～3個長短不同的偽足，有一個較大的卵原形核，細胞界限清楚。開始單個細胞一般鋪展很開，細胞間排列疏松，有較大的細胞間隙;隨后細胞增多，細胞相互平行排列，成群細胞呈漩渦狀或放射形。見圖1。

2.2 MMC對KFB增殖活性的影響 2.5 μg/ml的MMC即對細胞生長有明顯的抑制作用，這種抑制作用在200 μg/ml時達到最大，顯示出明顯的劑量-效應依賴關(guān)系。隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞生長抑制率呈現(xiàn)上升趨勢，作用48、72 h與24 h相比有極顯著差異(P＜0.01)，作用72 h與48 h相比有上升趨勢，但差異不顯著;24 h為最佳作用時間，所用細胞在最大劑量和最長時間藥物作用后均無壞死。見圖2。

圖1 體外KFB形態(tài)學觀察(×200)

圖2 MMC對KFB增殖活性的影響

圖3 各組TGF-β1mRNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 不同濃度的MMC對TGF-β1mRNA表達的影響 RNA提取后，經(jīng)Bio-mini測定，A260/A280均為1.8～2.0。瓊脂糖凝膠電泳顯示所提RNA完整，降解較少，表明RNA提取成功。總RNA擴增產(chǎn)物電泳后背景清晰，未見電泳條帶，表明無基因組DNA污染。TGF-β1mRNA RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳為110 bp的條帶，結(jié)果與預期一致，證明所擴增產(chǎn)物為目的片段。見圖3。正常對照組及 2.5、12.5、50、100、200 μg/ml MMC干預組的 TGF-β1mRNA相對表達量分別為0.88±0.07，0.80±0.06，0.51 ±0.04，0.47 ±0.05，0.36 ±0.03和0.22±0.02。MMC干預組TGF-β1mRNA相對表達量明顯低于正常對照組，從12.5 μg/ml MMC開始具有顯著差異(P＜0.01);隨MMC濃度增大，MMC干預組TGF-β1mRNA相對表達量呈逐漸降低趨勢。

3 討論

瘢痕疙瘩是皮膚損傷后傷口愈合過程中出現(xiàn)KFB過度增殖、膠原大量沉積，也是皮膚損傷后組織異常修復的結(jié)果。目前對瘢痕發(fā)生的機制仍知之甚少。目前臨床多采用局部藥物注射、壓迫治療、手術(shù)和激光治療等綜合治療，效果不明顯。

研究表明，MMC對KFB增殖有抑制作用，可能是通過調(diào)控CyclinD1/CDK4/P27通路中各因子表達平衡、使細胞周期停滯于G1/S期而實現(xiàn)〔2〕。MMC的主要作用是對于KFB增殖具有較強抑制作用，是氟尿嘧啶的100倍，并有時間依從性，作用時間可達到無限期抑制增生;同時與劑量密切相關(guān)，大劑量時可以成為不可逆性抑制〔3〕。有研究表明，手術(shù)切除瘢痕疙瘩后，局部使用MMC取得了滿意的臨床效果〔4〕。于冬梅等〔5〕實驗結(jié)果表明，MMC對體外培養(yǎng)KFB增殖的抑制作用與藥物濃度、處理時間有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)低劑量MMC對KFB的作用是通過下調(diào)Cyclin D1抑制細胞增殖和激活caspase-3誘導細胞凋亡而實現(xiàn)的。應用MMC處理KFB，能抑制KFB的增殖;在每一時間段，隨著濃度的增加，細胞生長抑制率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，顯示明顯的劑量-效應依賴關(guān)系〔3〕。劉鶯等〔6〕證實 100 μg/ml MMC對KFB細胞的增殖抑制效果最佳，為該藥物臨床應用提供了有力的實驗依據(jù)。

本實驗中MTT結(jié)果顯示，MMC對KFB的增殖活性有明顯抑制作用，這種作用隨藥物濃度、時間的升高明顯增強，200 μg/ml MMC對KFB的增殖抑制作用最佳。

TGF-β1是目前公認的與瘢痕疙瘩形成最為密切的細胞因子〔7〕。TGF-β家族成員包含許多結(jié)構(gòu)上的多肽段生長因子，對表皮細胞的生長、分化、凋亡及腫瘤形成具有調(diào)控作用〔8〕。其受體是普遍存在于正常細胞及腫瘤細胞表面上的一種跨膜糖蛋白，具有高度的特異性和親和力。TGF-β1可直接刺激血管生成，刺激Fb增殖及細胞中葡萄糖與氨基酸的轉(zhuǎn)運和糖酵解的進行〔9〕，導致 Fb合成膠原〔10〕、纖維連接蛋白和層黏連蛋白增加，同時也抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性和促進MMPS組織抑制劑(TIMPs)與纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)基因的表達，進而抑制ECM的降解;還介導血小板源性生長因子、結(jié)締組織生長因子的致纖維化作〔11〕;增加細胞與ECM的相互作用，促進纖維黏連蛋白和膠原基質(zhì)的黏附，促進瘢痕的形成。陳偉等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的存在會不斷刺激KFB誘導基質(zhì)產(chǎn)生，導致ECM的過度沉積。曹艷杰等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)丹參涂膜劑可改善增生期瘢痕微循環(huán)局部缺氧狀態(tài)，抑制成熟過渡期瘢痕微循環(huán)血供，也可顯著降低TGF-β1在肥厚性瘢痕中的光密度值，而丹參活血化瘀中藥可抑制瘢痕組織內(nèi)細胞因子TGF-β1的表達。

本實驗結(jié)果顯示，MMC干預組較對照組TGF-β1mRNA降低;隨作用時間增加，TGF-β1mRNA表達變化越為明顯，在處理72 h后，TGF-β1mRNA表達變化最明顯，且在藥物濃度為200 μg/ml時 TGF-β1mRNA 表達量減弱最明顯。提示 TGF-β1有助于瘢痕疙瘩的形成，MMC可能通過減少TGF-β1表達，從而起到抑制瘢痕增生的作用。

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〔2012-01-10收稿 2012-01-20修回〕

(編輯 袁左鳴)

The effect of mitomycin C on proliferation of keloid fibroblasts

SUN Kui，WU Xiao-Ming，SUN Yan-Jun，et al.
The Affiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，Hebei，China

Objective To study the effect of mitomycin C(MMC)on cell proliferation of keloid fibroblasts(KFBs).Methods The different concentration of MMC was used to KFB，the activity of KFB and TGF-β1 mRNA expression were tested.Results At 24，48，72 h，the growth inhibition rate was increased，TGF-β1 mRNA expression was gradually decreased with the MMC concentration increased.Conclusions MMC could attenuate the expression of TGF-β1 mRNA.

Keloid;Fibroblast;Mitomycin C;Proliferation;Transforming growth factor-β

R34

A

1005-9202(2012)17-3723-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.050

孫 奎(1971-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事燒傷整形外科學的研究。