通過下調Lewis肺癌細胞Vav3基因的表達抑制細胞增殖

王紹清 于秀文 趙春明 胡 南 (齊齊哈爾醫學院病理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

通過下調Lewis肺癌細胞Vav3基因的表達抑制細胞增殖

王紹清 于秀文 趙春明 胡 南 (齊齊哈爾醫學院病理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 通過下調Lewis肺癌細胞Vav3基因的表達，觀察Vav3表達對Lewis肺癌細胞體外增殖能力的影響。方法 設計合成3條針對小鼠Vav3的小干擾RNA序列(Vav3-mus-163，Vav3-mus-309，Vav3-mus-375)，瞬時轉染至Lewis肺癌細胞，采用Real-time PCR和Western印跡方法檢測干擾前后Vav3的表達，并挑選出下調效果最好的一條干擾序列進行細胞MTT實驗，分別在24、、72 h觀察下調Vav3基因表達后對Lewis肺癌細胞體外增殖能力的影響。結果 瞬時轉染三條siRNA序列Vav3-mus-163、Vav3-mus-309、Vav3-mus-375，檢測Vav3基因相對表達含量分別為1.121 7±0.105 5、2.030 5±0.386 1和3.175 9±0.730 4。分別與Lewis肺癌細胞組(6.704 5±0.183 3)和陰性對照組(6.083 7±0.317 2)相比，轉染Vav3-mus-163組和轉染Vav3-mus-375組的Lewis肺癌細胞Vav3基因表達明顯下調(P＜0.01，P＜0.05)。在蛋白水平瞬時轉染三條小干擾RNA序列Vav3的表達分別為0.112 8±0.005 8、0.203 2±0.008 3、0.293 8±0.219 1，與Lewis肺癌細胞組(0.408 3±0.004 6)和陰性對照組(0.388 9±0.005 4)比較，轉染Vav3-mus-163組Vav3蛋白表達明顯下調(P＜0.05)。Vav3-mus-163序列能夠在mRNA水平和蛋白水平顯著下調Vav3的表達。MTT法檢測瞬時轉染Vav3-mus-163后72 h細胞的增殖率為78.4%，與陰性對照組細胞增殖率92.9%相比差異顯著(P＜0.05)。結論 下調Lewis肺癌細胞中Vav3的表達，可使癌細胞的增殖能力下降，說明Vav3具有促進Lewis肺癌細胞增殖的作用。Vav3表達與肺癌的發生發展有關聯。

Vav3;小干擾RNA;Lewis肺癌細胞;增殖

鳥嘌呤核苷酸交換因子(Vav)3屬于Vav家族成員之一，活化的Vav可以催化Rho家族GTP酶活化蛋白(GTPase)結合的GDP變為GTP，從而激活GTPase活性，在細胞骨架調節、黏著斑通路、信號轉導及細胞運動等過程中發揮重要調節作用〔1〕。有研究表明 Vav3 具有原癌基因的功能〔2，3〕。本文通過瞬時轉染小干擾RNA(siRNA)序列下調Lewis肺癌細胞(LLC)中Vav3中的表達，觀察其對肺癌細胞體外增殖能力的影響，進一步闡明Vav3在Lewis肺癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LCC購自湖南遠泰生物技術公司，一抗山羊Vav3 antibody，二抗兔抗山羊IgG/辣根過氧化物酶(HRP)(Santa Cruz);Opti-MEM?I低血清培養基，LipofectamineTM2000(Sigma);蛋白提取試劑盒(ProMab);MTT檢測試劑盒(KGA);Trizol(Invitrogen);RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit、Deoxyribonuclease I、RiboLockTMRibonuclease Inhibitor(Fermentas)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 LCC培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基，置于37℃，5%CO2細胞培養箱。

1.2.2 siRNA序列合成 四條siRNA雙鏈由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。Vav3-mus-163:正義5'UGG ACC CAG GUU UGC CGA ATT 3'，反義 5'UUC GGC AAA CCU GGG UCC ATT 3';Vav3-mus-309:正義5'GGA CGA AAC UUA GCU UCA GTT 3'，反義 5'CUG AAG CUA AGU UUC GUC CTT3';Vav3-mus-375:正義 5'GUA CCU AAA CCA GUA GAU UTT 3'，反義 5'AAU CUA CUG GUU UAG GUA CTT 3';熒光標記陰性對照(Negative control，NC-FAM):正義 5'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3'，反義 5'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3'。鼠GAPDH-420:正義 5'CAC UCA AGA UUG UCA GCA ATT 3'，反義5'UUG CUG ACA AUC UUG AGU GAG 3'。

1.2.3 siRNA瞬時轉染 實驗分為5組:組1為未作處理組(LLC);組2:轉染熒光標記的陰性序列對照組(Vav3-mus-NC);組3:轉染 Vav3-mus-163;組4:轉染 Vav3-mus-309;組5:轉染Vav3-mus-375。

將5×104LCC接種在6孔板上，每孔含2 ml 10%FBS的DMEM培養基，24 h后細胞融合達到70%進行轉染 。250 μl Opti-MEM?I稀釋5 μl LipofectamineTM2 000，混勻室溫下孵育5 min。250 μl Opti-MEM?I稀釋 7.5 μl siRNA，室溫下混勻。上述兩種液體混合，在室溫下孵育20 min，形成復合物。將siRNA-LipofectamineTM2000復合物加入到接種細胞的六孔板中并混合。37℃，5%CO2培養箱孵育6 h，對轉染熒光標記的陰性序列對照組進行熒光檢測并更換含10%FBS的DMEM培養基;孵育48 h后，收集各組細胞進行Western印跡、Real-time PCR檢測。

1.2.4 Western印跡 提取細胞總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h。加入一抗山羊Vav3抗體(1∶400)，室溫結合3 h。加入二抗兔抗山羊(1∶4 000)，室溫結合1 h。PVDF膜依次與抗體作用后與免疫印跡化學發光。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參。選取下調效果最好的siRNA序列進行后續MTT實驗。

1.2.5 Real-time PCR 總RNA提取:每樣孔加入0.8 ml Trizol，按試劑使用說明提取細胞總RNA。基因組DNA的去除:按順序依次加入總 RNA 1 μg，10×反應緩沖液 1 μl，Ribo-LockTMRibonuclease9 μl，再加入 DNase I(1 U/μl)1 μl，37℃孵育 30 min;加入 1 μl 25 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，65℃溫育10 min使酶失活。

反 轉 錄 (20 μl 體 系): 總 RNA 2 μg，Oligo(dT)18(0.5 μmol/μl)1 μl，加入 DEPC 處理水至 11 μl，70℃ 5 min，冰上冷卻。5×反應緩沖液 4 μl，4種 dNTP混合物(10 mmol/μl)2 μl，Ribonuclease 抑制劑(40 U/μl)0.5 μl，37℃ 5 min。Revert AidTMM-MulV 逆轉錄酶 (200 U/μl)1 μl，42℃ 60 min，70℃10 min后置于冰上。

Real-time PCR(25 μl體系):取上述反轉錄產物 1 μl，Vav3及GAPDH上下游各100 mmol/L，2×SYBR Green PCR Master混合液 12.5 μl，加 ddH2O至 25 μl。然后按下述條件反應:95℃ 5 min，94℃ 20 s，(Vav3 基因 56℃、GAPDH 基因 59℃)20 s，72℃ 20 s共40 個循環，72℃ 20 s，55℃ 10 s。見表1。

表1 小鼠Vav3及GAPDH擴增序列

1.2.6 MTT方法檢測細胞增殖活性 實驗步驟按MTT檢測試劑盒說明書進行。在96孔板加入細胞100 μl/孔(1×104個細胞)，置于37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24 h。每孔加50 μl 1 × MTT，在 37℃ 孵育 4 h。吸出上清液，每孔加 150 μl DMSO使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。酶標儀在570 nm波長處檢測每孔的光密度。細胞存活率% =(干擾組細胞OD－本底OD/對照細胞OD－本底OD)×100%。

1.3 統計學方法 應用SSPS13.0統計軟件進行分析，所有數據用±s表示，資料數據進行方差分析。

2 結果

2.1 轉染率檢測 轉染后6 h，通過比對帶有熒光標記的對照組細胞熒光鏡與光鏡下圖像，觀察siRNA的轉染效率達到70%以上。

2.2 Real-time PCR檢測 目的基因的擴增曲線符合4個特征性階段的平滑的S型曲線，陰性對照(模板為水)無顯著熒光信號，目的基因得到有效擴增。在熔點曲線中顯示形狀只有一個峰值，沒有出現雜峰，提示無非特異性熒光信號，目的基因擴增產物單一。用2－ΔΔCt表示樣品中Vav3 mRNA相對定量。Vav3 mRNA相對含量在第3組、第4組細胞中表達較1、2組明顯下調(P＜0.001，P＜0.05)，差異有統計學意義。見表2。

2.3 Western印跡分析 轉染Vav3-mus-163序列的第3組細胞中Vav3蛋白表達明顯下調。半定量分析蛋白表達的光密度值，第3組細胞中Vav蛋白表達下調明顯，與第1組及第2組細胞相比差異有統計學意義(P＜0.05)。結果顯示轉染VAV3-siRNA-163對Vav3基因的沉默效應最好，可以用于后續MTT實驗。見圖1，表2。

2.4 MTT檢測細胞增殖活性 分別在轉染VAV3-siRNA-163后24、48、72 h后檢測細胞的增殖率，結果顯示轉染后72 h LLC增殖能力明顯下降，與第1組及第2組細胞比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

圖1 各實驗組細胞Vav3蛋白表達

表2 各組細胞中Vav3 mRNA和蛋白相對含量(±s，n=4)

表2 各組細胞中Vav3 mRNA和蛋白相對含量(±s，n=4)

與組1、組2比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01;下表同

組別 Vav3 mRNA Vav3蛋白組1 3.175 9±0.730 4 0.293 8±0.219 1 6.704 5±0.183 3 0.408 3±0.004 6組2 6.083 7±0.317 2 0.388 9±0.005 4組3 1.121 7±0.105 52)0.112 8±0.005 81)組4 2.030 5±0.386 11)0.203 2±0.008 3組5

表3 各組細胞72 h的OD值(±s，n=4)

表3 各組細胞72 h的OD值(±s，n=4)

與1組、2組比較:1)P＜0.05

組別 OD值 增殖率(%)組1 78.4 0.792 5±0.142 0 100.0組2 0.736 0±0.184 5 92.9組3 0.621 5±0.104 71)

3 討論

Vav3基因定位于1號染色體，蛋白表達于胞質中，分子量為97 kD，在體內廣泛分布。Vav3作為一種鳥嘌呤交換因子參與多種信號通路傳導及細胞轉化過程調節〔1〕。靜息狀態下Vav3 Ac結構域上174位的酪氨酸殘基的磷酸化是Vav3活化的關鍵，上游Src家族及Syk家族酪氨酸蛋白激酶可以通過這種磷酸化形式激活Vav3〔4〕。活化后的Vav3通過C3肉毒素底物/蛋白活化激酶(Rac1/PAK)通路調控血管平滑肌細胞的增殖和運動功能，對維持心血管系統的穩態可能發揮重要作用〔5，6〕。原代神經細胞培養顯示，Vav3促進神經細胞樹突分支發育，而且在Vav3缺失小鼠模型中對小鼠小腦發育過程起重要的調節作用〔7〕。研究發現，Vav1/2/3缺失小鼠模型產生無效應的T細胞或B細胞，而且T細胞受體通路和B細胞受體信號通路也被破壞，說明Vav3參與T細胞和B細胞發育過程〔8〕。已有研究表明Vav3在多種腫瘤組織及腫瘤細胞中表達增加〔2，3，9，10〕，具有原癌基因的功能。在前列腺癌〔2〕和乳腺癌〔3〕的癌細胞中Vav3表達增加，并且通過磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路激活AR及ERα活性，促進腫瘤細胞的生長。

本研究結果提示，Vav3表達下調后，腫瘤細胞增殖率降低，說明Vav3在調控LLC生長過程中發揮重要的作用。作為一種鳥嘌呤調節因子，Vav3在相應的刺激因子作用下發揮其鳥嘌呤交換因子(GEF)活性，調節Rho家族GTPase活性，如Rac1、Cdc42、RhoA，進一步激活 MAPK信號通路、JNK信號通路，發揮改變細胞形態、促進細胞生長和誘導細胞轉化等生物學效應，或者通過核轉錄因子(NF)-κB等轉錄水平的活性促進細胞增殖〔10〕。Vav3在調控LLC生長的機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究首次在細胞水平初步證實了Vav3在LLC中的表達及Vav3的表達與細胞增殖能力有關，Vav3在Lewis肺癌發生發展過程中可能有著重要的作用。

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〔2012-01-04收稿 2012-01-24修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2012)17-3726-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.051

黑龍江省衛生廳科研課題(No.2010-231)

王紹清(1979-)，男，博士，講師，主要從事腫瘤遺傳學方面的研究。