TRAIL聯合順鉑誘導膠質瘤細胞凋亡的機制

嚴 海 齊 玲金 宏趙東海溫 娜于洪泉

(北華大學第二附屬醫院腦外科，吉林 吉林 132022)

TRAIL聯合順鉑誘導膠質瘤細胞凋亡的機制

嚴 海 齊 玲1金 宏1趙東海1溫 娜1于洪泉2

(北華大學第二附屬醫院腦外科，吉林 吉林 132022)

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體;順鉑;腦質瘤

作為新型的抗腫瘤藥物，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)已進入臨床Ⅱ期試驗階段〔1〕。研究發現，TRAIL可以誘導包括膠質瘤在內的多種腫瘤細胞發生凋亡，但大多惡性膠質瘤細胞對TRAIL耐藥〔2〕。前期研究的實驗發現，原代培養的膠質瘤細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性不同，檢測發現死亡受體(DR)5的表達量不同，并當TRAIL與化療藥物聯合作用后可發揮協同作用〔3～5〕。因此，本文進一步對TRAIL與化療藥物聯合作用誘導膠質瘤細胞凋亡的機制進行研究，為TRAIL作為腫瘤治療新藥提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 小牛血清、DMEM/F12培養基、0.25%胰酶(Gibco公司);rhTRAIL(Peprotech 公司);順鉑(cisplatin，Sigma公司);鼠抗人Caspase-8單克隆抗體(Cell Signaling公司);兔抗人肌動蛋白(Actin)多克隆抗體(Sigma公司);過氧化物酶標記羊抗鼠(兔)IgG第二抗體(Jackson Immunoresearch公司)。

1.2 細胞培養 從-80℃冰箱中取出凍存的早期原代惡性膠質瘤 GC125 細胞〔4，6〕，復蘇后離心棄上清，重懸細胞，將細胞接種于25 cm2培養瓶中，加入10%DMEM/F12培養液，將培養瓶置入37℃、5%CO2孵箱、飽和濕度下進行培養，隔日換液，1∶3傳代。

1.3 Western印跡檢測藥物作用后惡性膠質瘤細胞凋亡情況〔3〕將細胞分為四組，分別為對照組(不加藥物)、TRAIL組(300 ng/ml)、聯合用藥組(TRAIL 300 ng/ml+順鉑10 μg/ml)、順鉑組(10 μg/ml)。待細胞生長90%左右，加入藥物作用3 h。收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，3 000 r/min離心5 min棄上清。PBS再次充分洗滌細胞，離心棄上清，每個樣品加入50 μl的細胞裂解液，細胞充分裂解后，12 000 r/min 4℃離心15 min，上清移于另一管中，棄沉淀，Braford法檢測樣品蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)跑膠分離樣品，4℃轉膜封閉后，加入一抗4℃孵育過夜。加入相應的二抗，室溫、避光孵育1 h，膠片曝光拍照。

2 結果

加入TRAIL和(或)順鉑后觀察GC125細胞發生凋亡反應情況。在聯合用藥組可見到明顯的凋亡小體，并且隨著作用時間的增加，細胞發生凋亡的數量明顯增多;在藥物作用于細胞3 h后提取蛋白，每孔加入80 μg蛋白，跑膠分離蛋白，并加入Caspase-8抗體。曝光后可見到細胞發生Caspase-8裂解反應。見圖1。

圖1 惡性膠質瘤GC125細胞經TRAIL聯合順鉑作用后發生凋亡級聯裂解反應的情況

3 討論

美國腦腫瘤注冊中心2008年統計結果顯示，惡性膠質瘤占原發性惡性腦腫瘤的70%，年發病率為5/100 000，每年新發病例超過14 000例。但由于惡性膠質瘤在腦內呈彌散分布〔7〕，故手術難以清除。這可能是由于激活細胞生長途徑和(或)抑制細胞凋亡途徑而對治療抵抗〔8〕。作為研究的熱點，TRAIL雖可以誘導多種腫瘤細胞發生凋亡，但卻存在著耐藥現象，迄今為止，科研人員還在對攻克這一難題做著不懈的努力。

TRAIL作用于細胞后與細胞表面的DR5結合，再通過胞內受體的死亡結構域(DD)募集胞內特異性的凋亡相關因子(FAS)相關死亡結構域(FADD)，FADD上的死亡效應域(DED)又募集Caspase-8前體，通過裝配成DR5-FADD-Caspase-8死亡誘導信號復合體(DISC)激活Caspase-8，引發凋亡級聯裂解反應，使細胞發生凋亡〔9〕。Caspase-8有兩種同分異構體P55和P53，通過DED，Caspase-8被FADD募集到DISC，經兩步自體蛋白水解過程釋放P18、P10兩個亞單位，Caspase-8發生活化裂解引起細胞凋亡。

本實驗對惡性膠質瘤GC125細胞進行研究，應用TRAIL與順鉑分別或聯合作用于細胞后，經Western印跡檢測顯示，對照組與順鉑組均未見明顯的Caspase-8凋亡級聯裂解反應，TRAIL組可見到少量的Caspase-8二步裂解產物P18片段，聯合用藥組則可見到明顯的P18裂解片段。初步說明TRAIL與順鉑聯合作用后，可增強TRAIL的誘導凋亡作用，使惡性膠質瘤細胞發生凋亡，這可能是通過增加細胞Caspase-8活化而引起。但惡性膠質瘤發生TRAIL耐藥的機制，還需進一步研究。

1 Bellail AC，Qi L，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，2009;4(1):34-41.

2 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.

3 南栗巖，齊 玲，肖振晶，等.原代培養的惡性膠質瘤細胞表達死亡受體與TRAIL抵抗的關系〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(18):3591-2.

4 嚴 海，張 宇，于洪泉，等.腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體對膠質瘤細胞的誘導凋亡作用〔J〕.中國實驗診斷學，2011;15(8):1355-6.

5 金 宏，張 宇，于洪泉，等.壞死因子相關凋亡誘導配體聯合化療藥物對膠質母細胞瘤細胞的殺傷作用〔J〕.中風與神經疾病雜志，2011;28(7):639-40.

6 齊 玲，金 宏，丁麗娟，等.腦腫瘤干細胞的培養及生物學特性研究〔J〕.中國實驗診斷學，2011;15(2):227-8.

7 Holland EC，Glioblastoma multiforme:the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(12):6242-4.

8 Smyth MJ，Takeda K，Hayakawa Y，et al.Nature's TRAIL-on a path to cancer immunotherapy〔J〕.Immunity，2003;18(1):1-6.

9 Bellail AC，Tse MC，Song JH，et al.DR5-mediated DISC controls caspase-8 cleavage and initiation of apoptosis in human glioblastomas〔J〕.J Cell Mol Med，2010;14(6A):1303-17.

〔2012-01-18收稿 2012-02-10修回〕

(編輯 袁左鳴)

R739.41

A

1005-9202(2012)17-3751-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.062

吉林省自然科學基金(No.202015242);吉林省教育廳項目(No.2012330，2011281);吉林醫藥學院留學歸國博士科研啟動基金(No.201101)

1 吉林醫藥學院病理教研室 2 吉林大學第一臨床醫院神經外科

于洪泉(1974-)，男，博士，主治醫師，主要從事腦膠質瘤綜合治療研究。

嚴 海(1974-)，男，主治醫師，主要從事腦腫瘤藥物治療研究。