熒光定量PCR技術(shù)的原理與應用

王志平

(1渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南714000;2陜西省多河流濕地生態(tài)環(huán)境重點實驗室，陜西渭南714000)

聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)是一項DNA體外擴增技術(shù)，主要應用于特異性基因的檢測以及生物鑒定等方面.1983年P(guān)CR技術(shù)發(fā)明以來，生物技術(shù)迅猛發(fā)展.早期的PCR定量方法都是基于產(chǎn)物的終點濃度測定，20世紀90年代實時(real-time)PCR的發(fā)明推動了PCR定量技術(shù)的發(fā)展與應用［1－2］.熒光定量PCR是在普通PCR技術(shù)基礎上建立的一種核酸定量技術(shù)，即在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累對整個PCR進程進行實時監(jiān)測，并根據(jù)標準曲線對未知模板進行定量.目前，該技術(shù)已廣泛應用于疾病診斷、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測以及分子生物學研究等領域，而且其應用范圍仍在不斷拓展.

1 熒光定量PCR技術(shù)原理

在熒光定量PCR反應體系中加入一種熒光化學物質(zhì)，目前，最常用的是SYBR GreenⅠ染料，它能與雙鏈DNA小溝部位結(jié)合，而且具有綠色激發(fā)波長.在PCR進程的復制和延伸階段，該染料插入DNA雙鏈中發(fā)出熒光，在變性階段，由于DNA雙鏈解開，染料從DNA分子上游離下來而不產(chǎn)生熒光，因此熒光信號的強弱與雙鏈DNA的量成正比.PCR進程中，隨著產(chǎn)物的積累，熒光信號的強度等比加強.每經(jīng)過一次循環(huán)，收集一次熒光信號，即可得到一個熒光擴增曲線(圖1)，根據(jù)熒光強度的變化即可監(jiān)測產(chǎn)物量的變化.

通常，熒光擴增曲線可分為三個階段，即熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期.在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此可以在該階段進行定量分析.為了便于對所檢測樣本進行比較，在指數(shù)期需要設定一個熒光信號的閾值.檢測到的熒光信號超過閾值則被認為是真正的信號.熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段的閾值所對應的循環(huán)次數(shù)稱為Ct值.模板的Ct值與其起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，則Ct值越小(圖2).利用已知起始拷貝數(shù)的標準品及其相應的Ct值可繪制出標準曲線，測得未知樣品的Ct值后，根據(jù)標準曲線便可準確計算出該樣品的起始拷貝數(shù).

2 熒光定量PCR技術(shù)的應用

定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，有效解決了PCR污染和定量不準確等問題.首先，該技術(shù)特異性強、靈敏度高，可以對小于5拷貝的靶基因序列進行定量分析，也可以對表達差異極其微小的基因進行比較分析;其次，該技術(shù)定量準確，整個過程在全封閉的容器中進行反應，不需要對產(chǎn)物進行染色以及電泳檢測等后續(xù)操作，極大地降低了交叉污染的可能性;另外，該技術(shù)簡便快速高效，便于高通量自動分析［3］，已成為科學研究與生產(chǎn)實踐的重要工具之一.

圖2 模板量與Ct值的關(guān)系

2.1 在疾病診斷與治療中的應用

在疾病診斷中，樣品內(nèi)病原體達到一定數(shù)量才具有臨床意義，因此必須對樣品中的病原體進行定量才能作為診斷依據(jù)，并為藥物治療以及后續(xù)觀察提供參考.傳統(tǒng)PCR技術(shù)及凝膠電泳在病原體的定性檢測中具有較高靈敏度，然而卻不能實現(xiàn)病原體的準確定量.相比之下，定量PCR技術(shù)在疾病診斷與治療的應用卻逐步得到了推廣.目前，熒光定量PCR技術(shù)已成功應用于人類乳頭瘤病毒、肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒等，以及結(jié)核桿菌、支原體、衣原體等多中病原體的檢測研究［4］.例如，Kessler等發(fā)現(xiàn)利用定量PCR技術(shù)可以對乙型肝炎病毒感染的不同程度進行鑒定，從而為后續(xù)治療提供參考依據(jù)［5］.

癌基因在致癌因子作用下表達增加或突變通常是在腫瘤發(fā)生早期和良性階段，導致腫瘤很難被及時診斷與治療.熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展與應用則能夠有效解決這一技術(shù)難題，它不但能夠有效檢測癌基因的突變，而且能夠?qū)Π┗虻谋磉_水平進行準確定量，從而用于腫瘤的早期診斷、分型、分期以及預后判斷.例如，F(xiàn)errari等發(fā)現(xiàn)可以將癌基因在盆腔淋巴結(jié)中的表達情況作為前列腺癌治療的預后標志，對腫瘤轉(zhuǎn)移情況進行分析［6］.另外，利用該技術(shù)可觀測用藥前后及復發(fā)時腫瘤細胞中耐藥基因的表達變化，為研究腫瘤耐藥、指導臨床治療提供有效途徑［7］.

熒光定量PCR技術(shù)在獸醫(yī)研究中也得到越來越廣泛的應用.例如，關(guān)于貓冠狀病毒和萊姆病等多種病原體的熒光定量PCR檢測方法均已建立.有研究表明，用定量PCR能夠快速靈敏地檢測雞傳染性支氣管炎病毒［8］，牛偉等建立了定量檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的熒光定量PCR方法［9］，從而為相關(guān)疾病的診斷與治療提供有效依據(jù).

在新藥開發(fā)的研究過程中，熒光定量PCR技術(shù)可以快速了解藥物對疾病進程的影響，為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力、時間和資金.

2.2 在食品檢測方面的應用

目前，熒光定量PCR技術(shù)已廣泛應用于食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因食品以及動物源性食品的檢測等方面.邵彪等發(fā)現(xiàn)利用多重熒光定量PCR可以在同一反應體系下同時對食品中多種污染菌進行準確快速的檢測［10］.在食品發(fā)酵過程中，利用熒光定量PCR技術(shù)可以直接檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的微生物種群，而不需要培養(yǎng)活菌，因此可以縮短檢測程序，提高檢測效率.

在轉(zhuǎn)基因食品檢測方面，裘劼人等驗證了利用熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)的可行性［11］.Muleg等利用該技術(shù)檢測葡萄中曲霉菌的污染程度［12］.日本和美國等13個實驗室運用熒光定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米和轉(zhuǎn)基因大豆進行了定量研究，結(jié)果表明，熒光定量PCR技術(shù)可以應用于轉(zhuǎn)基因作物標識制度的實際檢測［13］.

2.3 在環(huán)境監(jiān)測方面的應用

環(huán)境中存在許多致病微生物，它們與疾病傳播密切相關(guān).因此，定期檢測環(huán)境中致病微生物的種類、數(shù)量及其變化趨勢對于傳染病的預防和控制具有重要意義.與傳統(tǒng)的環(huán)境微生物病原體檢測方法相比，熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點.Brooks等的研究表明，定量PCR技術(shù)對甲肝病毒的定性及定量測定均有很高的精確度［14］.Rebecca等建立了利用定量PCR技術(shù)對易引起水傳播疾病的賈第蟲和隱孢子蟲進行定量分析的方法［15］.李偉等建立了應用熒光PCR技術(shù)定量檢測土壤和臟器中炭疽芽孢桿菌的方法［16］.Grtintzig等利用熒光定量PCR技術(shù)檢測環(huán)境樣品中功能基因(反硝化亞硝酸鹽還原酶基因)的豐度，進而分析不同環(huán)境中施氏假單胞菌的豐度［17］.何閃英和吳小剛建立了定量檢測赤潮生物圓海鏈藻的實時定量PCR方法，為赤潮研究提供了有效的檢測技術(shù)［18］.

此外，利用熒光定量PCR技術(shù)還可以定量研究微生物的種類組成及數(shù)量變化，進而深入探索微生物群落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動態(tài)變化過程，為預測不同環(huán)境條件下微生物種類組成與數(shù)量變化趨勢提供依據(jù)，進而為傳染病的預防和控制提供參考.例如，Tay和Hemond利用定量PCR技術(shù)檢測了兩種甲苯降解菌自養(yǎng)黃色桿菌和分支桿菌在污染區(qū)和非污染區(qū)的數(shù)量分布情況以及兩種微生物數(shù)量的季節(jié)性變動［19］.

2.4 在遺傳學和分子生物學研究中的應用

在遺傳學研究中，利用熒光定量PCR技術(shù)可以進行點突變分析、突變基因檢測、等位基因分析、DNA甲基化檢測以及單核苷酸多態(tài)性分析等方面的研究.例如，利用熒光定量PCR并結(jié)合相關(guān)測序方法，可以對已知DNA序列的突變基因和序列多態(tài)性進行定位，也可通過擴增DNA限制性位點的方法來檢測遺傳變異.Bjerre等利用定量PCR技術(shù)進行了單核苷酸多態(tài)性和基因突變方面的研究［20］.若在擴增之前對DNA進行處理，然后用特異的引物和探針可以區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，從而研究不同處理對DNA結(jié)構(gòu)的影響.另有研究表明，利用熒光定量PCR技術(shù)還可以有效鑒定雜合子和純合子［21］.

在分子生物學研究中，熒光定量PCR技術(shù)主要用于基因表達研究.應用熒光定量PCR技術(shù)可對mRNA表達水平和動態(tài)變化進行研究，例如mRNA的直接定量分析、突變等位基因檢測、mRNA剪接變異體的檢測等，其中，在定量mRNA表達水平的研究中應用最為普遍.此外，該方法還用于細胞凋亡的研究.例如，路釗等運用該技術(shù)研究了BATF2/SARI轉(zhuǎn)錄因子誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制［22］.

2.5 在法醫(yī)鑒定中的應用

目前，熒光定量PCR技術(shù)在法醫(yī)上主要應用于親子鑒定和個人識別，從血痕、精斑、毛發(fā)、骨或其他組織中提取DNA后，通過DNA分型或DNA指紋可以進行親子鑒定或個人識別，從而為案例偵破提供有效的法律依據(jù).

3 結(jié)語

熒光定量PCR技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的DNA定量檢測方法，可以彌補普通PCR的許多不足，在傳統(tǒng)醫(yī)學、食品檢驗、環(huán)境監(jiān)測及生物學研究等領域的應用逐步得到推廣.隨著熒光定量PCR技術(shù)的不斷改進和完善，它將在基礎研究領域和生產(chǎn)實踐中發(fā)揮出更大的應用價值.

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