三葉因子2、表皮生長因子在大鼠胃潰瘍愈合中的作用

張 靜 房 濤 馬義騰 吳靖芳 張江蘭 張文靜

(河北北方學院組織胚胎學教研室，河北 張家口 075000)

胃潰瘍是老年人好發的疾病之一，其愈合是一個復雜的生理過程，包括了組織的重建和再生〔1〕。三葉因子2(TFF2)作為TFF家族中最早被發現的小分子多肽，與表皮生長因子(EGF)均屬于黏膜屏障的修復因子〔2，3〕，研究二者在胃潰瘍愈合過程的表達變化，對深入研究潰瘍愈合機制及治療等方面具有一定的參考價值。本研究通過建立大鼠實驗性胃潰瘍模型，動態檢測胃黏膜TFF2、EGF蛋白及mRNA的表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 TRIzol、dNTP Mix購自北京賽百盛生物工程有限公司，TFF2、EGF、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)由北京賽百盛生物工程有限公司合成;白血病病毒(AMV)反轉錄酶(M9004)，RNAase抑制劑購自 Promega公司;2×Taq PCR體系購自北京盛旭百川生物工程公司，兔抗大鼠TFF2、EGF多克隆抗體購自武漢博士德生物技術有限公司;生物素-辣根過氧化物酶復合物(SP)9001試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.2 儀器 SIGMA3K30型低溫高速離心機、UV-2000型紫外分光光度計(美國Labtech公司)、Mastercycler 5331 PCR擴增儀(Eppendorf公司)、DYC-31D型水平凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠分析系統(UVP GELDOC-IT，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及取材 雄性8周齡SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)48只，體重180～230 g，分為實驗性胃潰瘍組(簡稱潰瘍組，GUG，n=42)和正常組(NG，n=6)。用3 g/100 ml戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，腹部剃毛，消毒，在無菌條件下(手術切口長約2 cm)暴露胃。在胃體前壁近胃竇處黏膜下注入0.01 ml冰醋酸，制成胃潰瘍模型。正常組為正常大鼠，不做任何處理。各組動物飼養條件相同，取材前禁食12 h，不限飲水。動物用戊巴比妥鈉麻醉后，迅速開胸，主動脈插管，剪開右心耳，首先灌注生理鹽水100 ml，繼之灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液250 ml，維持20 min。手術后1，2，4，6，10，14，23 d 分批取大鼠胃壁組織(每個時間點 6 只)，正常組與1 d同時取材。取材時沿胃大彎剪開大鼠胃壁，潰瘍組剪取潰瘍邊緣組織，正常組剪取近胃竇處胃組織，其中一部分組織置于Bouin液中，石蠟包埋，連續切片，厚4 μm，裱貼于涂有3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)的載片，行免疫組化染色;另一部分胃組織約100 mg置于液氮中備RT-PCR檢測。

1.2.2 免疫組織化學染色 石蠟切片常規脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液(pH6.0)95℃、15 min微波熱修復，3%甲醇-H2O2去除內源性過氧化物酶，滴加一抗(兩種抗體工作液濃度均為1∶100)，4℃孵育過夜，其余步驟按中杉金橋SP9001試劑盒步驟操作。常規DAB顯色，蘇木精復染細胞核，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為對照。

1.2.3 RT-PCR檢測胃TFF2 mRNA、EGR mRNA的表達 (1)Trizol法提取胃黏膜組織總RNA并鑒定。(2)反轉錄:反應總體系 20 μl，其中含總 RNA 2.5 μl、隨機引物 1 μl、AMV 0.5 μl、dNTPs 2 μl、RNAase 抑制劑0.5 μl。(3)PCR 擴增反應:反應總體系 20 μl，含有 cDNA 2 μl。引物序列及退火溫度見表 1。(4)PCR產物測定及分析:PCR反應產物于1.5%瓊脂糖中電泳，用UVP GELDOC-IT凝膠成像系統觀察并攝片。

1.3 圖像分析與統計學方法 免疫組織化學:用Motic軟件進行圖像半定量分析，每張切片隨機選取5個視野(20倍)，測定各組大鼠胃黏膜TFF2、EGF陽性目標積分光密度。RT-PCR結果用凝膠成像系統分別檢測TFF2、EGF和GAPDH條帶的吸光度，根據TFF2、EGF與GAPDH的吸光度比值對TFF2 mRNA、EGF mRNA表達水平進行半定量分析。數據均以±s表示，應用SPSS11.5統計軟件進行單因素方差分析和q檢驗。

表1 TFF2、EGF和GAPDH基因的特異性引物

2 結果

2.1 造模后胃組織大體形態改變 胃潰瘍術后1 d，大鼠胃體前壁即可見一個直徑約4 mm的潰瘍，邊界清楚，周圍黏膜呈環堤樣水腫隆起;術后2、4 d潰瘍最為明顯，潰瘍更加凹陷，潰瘍底或形成穿孔或被大網膜、胰腺、肝臟等組織粘連包裹;隨后潰瘍面積逐漸減小，組織逐漸變硬，形成瘢痕;至14 d左右，潰瘍直徑1～2 mm;術后23 d潰瘍部分已經接近愈合。見圖1。

2.2 胃黏膜TFF2、EGF蛋白表達變化 陽性反應物質均呈棕黃色。TFF2陽性蛋白表達于壁細胞、頸黏液細胞等胃底腺細胞的胞質。正常組大鼠胃黏膜TFF2蛋白呈弱陽性表達，潰瘍術后1 d組TFF2陽性細胞即顯著增多(P＜0.01);之后隨潰瘍術后時間的延長，TFF2表達呈漸增趨勢;至潰瘍術后6 d，TFF2積分光密度值達到高峰，陽性細胞以靠近黏膜肌層信號最強;之后TFF2積分光密度值雖呈降低趨勢，但仍高于對照組(P＜0.05)。EGF陽性蛋白表達于壁細胞、內分泌細胞、頸黏液細胞等細胞，除胞質表達外，也可見胞膜表達。正常組大鼠胃黏膜EGF蛋白呈弱陽性表達，潰瘍術后1 d EGF陽性細胞略有增多(P＜0.05);之后表達呈漸增趨勢，潰瘍術后4～10 d EGF陽性細胞數量明顯增多，表達明顯增強，10 d積分光密度值達到高峰;14、23 d積分光密度值雖略有降低，但仍顯著高于對照組(P＜0.01)。見圖2，見表2。

2.3 RT-PCR法檢測大鼠胃組織TFF2 mRNA、EGF mRNA表達 TFF2 mRNA、EGF mRNA是位于250～500 bp之間的一條清晰擴增帶，GAPDH為位于500～750 bp之間的一條清晰擴增帶，見圖3。OD比值結果見表3。

表2 大鼠胃黏膜TFF2、EGF陽性細胞積分光密度值變化(±s)

表2 大鼠胃黏膜TFF2、EGF陽性細胞積分光密度值變化(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與前一時間潰瘍組比較:3)P＜0.01

指標 正常組 潰瘍1 d 潰瘍2 d 潰瘍4 d 潰瘍6 d 潰瘍10 d 潰瘍14 d 潰瘍23 d TFF2 4.76±1.21 10.05±2.881)2)11.20±3.141)2)14.79±4.451)2)3)24.50±5.681)2)3)17.26±4.311)2)3)15.92±3.491)2)6.40±1.341)2)3)EGF 2.53±0.63 4.10±1.051) 6.80±1.311)2)3)12.30±0.621)2)3)16.52±0.681)2)3)19.10±0.461)2)3)17.24±2.051)2)3)16.68±1.881)2)

表3 大鼠胃黏膜TFF2/GAPDH mRNA、EGF/GAPDH mRNA吸光光度值(±s)

表3 大鼠胃黏膜TFF2/GAPDH mRNA、EGF/GAPDH mRNA吸光光度值(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與前一時間潰瘍組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

指標 正常組 潰瘍1 d 潰瘍2 d 潰瘍4 d 潰瘍6 d 潰瘍10 d 潰瘍14 d 潰瘍23 d TFF2 0.43± 0.01 1.13±0.111) 1.21±0.081) 1.74±0.141)4) 1.86±0.141)4) 1.59±0.141)4) 1.32±0.062)4) 0.64±0.072)4)EGF 0.80 ± 0.13 1.10±0.041) 1.18±0.081) 1.68±0.061)4) 1.73±0.141) 1.99±0.101)4) 1.68±0.052)4) 1.79±0.092)3)

圖1 大鼠胃潰瘍術后1 d胃黏膜形成龕形潰瘍(體視鏡)

圖2 TFF2、EGF在大鼠胃黏膜中的陽性表達 (SP，×200)

圖3 RT-PCR結果

3 討論

胃潰瘍是常見病和多發病，而潰瘍后的黏膜愈合過程直接關系到疾病的轉歸及復發。研究發現，一旦潰瘍形成，無論原因如何，其修復及愈合均經歷相似的過程〔4〕，這一過程是多種細胞和分子相互作用的復雜過程〔5〕，TFF2和EGF作為重要的防御性細胞因子參與了胃黏膜的愈合過程。TFF2與乳癌相關肽(pS2或TFF1)、腸TFF(ITF或TFF3)是TFF家族的三個成員，具有抑制胃動力的作用，故又稱為解痙多肽(SP)，是TFF家族中唯一一個具有兩個三葉草型結構域(P結構域)和糖基化的小分子蛋白質〔6〕，分布于潰瘍好發的胃竇和十二指腸。正常情況下，TFF2由胃腺的頸黏液細胞及十二指腸腺合成與分泌，分泌量較少，在急性損傷時分泌量增多，有實驗表明缺乏TFF2基因的小鼠對非甾體藥物誘導的潰瘍較為敏感〔7〕，這些結果說明TFF2在維持胃腸黏膜屏障和黏膜損傷后上皮修復中起著重要的作用。本文結果均顯示在大鼠胃潰瘍術后1 d，TFF2肽/基因即呈現高表達狀態，至術后6 d達到高峰，提示胃黏膜TFF2肽/基因在胃潰瘍損傷早期即被誘導表達，作為早期反應因子參與了黏膜的快速修復過程〔8〕。同時從免疫組化定位結果來看，TFF2陽性細胞主要表達于胃黏膜中下層，以靠近黏膜肌層陽性信號較強。而國外學者研究發現大鼠胃黏膜損傷后此部位的TFF2陽性細胞會伴有細胞核增殖抗原(PCNA)陽性〔9〕，提示TFF2表達可能與胃腺增殖有關，從而促進黏膜的修復。此外還有研究發現缺乏TFF2基因的小鼠胃酸含量呈兩倍增高〔8〕，提示TFF2具有抑酸作用。本實驗結果中，TFF2陽性物質可表達于壁細胞質，因此推測表達于壁細胞內的TFF2可能發揮了其抑制鹽酸分泌的作用，參與胃黏膜的保護。

EGF是一種作用廣泛的胃腸營養多肽，是一種抗潰瘍和促進潰瘍愈合的調節因子，正常情況下主要由唾液腺和十二指腸Brunner腺分泌。EGF具有耐熱和不被蛋白酶消化的特性，這一特性有利于EGF長時間作用于胃腸道黏膜，維持胃腸黏膜的不斷再生和更新。EGF具有抑制胃酸分泌、增加胃黏膜血流量、促進上皮增殖、組織修復等作用，在保護胃黏膜免受損傷因子的破壞、維持胃黏膜完整性方面起著非常重要的作用，也是近年發現的在細胞增殖和分化中起重要作用的分子〔10〕。本文發現，大鼠胃潰瘍術后4～10 dEGF蛋白/mRNA呈現高水平表達，此狀態可維持到黏膜修復后期，說明在胃黏膜潰瘍愈合過程中，胃黏膜自身可產生大量EGF，通過自分泌或旁分泌的方式參與黏膜修復過程。同時在實驗中發現，EGF陽性細胞也主要分布于近黏膜肌層，此部位與胃腺增殖關系密切，推斷此表達特點可能與其具有促進胃黏膜細胞DNA和RNA的合成和有絲分裂，促進細胞分裂、分化、增殖、遷移等作用有關〔11〕，這是黏膜損傷后修復的必要條件。EGF陽性物質除見于內分泌細胞中，也可見表達于壁細胞中，此定位特點與其抑制鹽酸分泌的特性有關。由此可見，在大鼠胃潰瘍自愈時期胃黏膜能特異性表達內源性TFF2和EGF，二者共同參與了潰瘍愈合過程，但二者在表達時相上略有差異。國外研究發現，TFF2作為初始反應基因最早出現在黏膜損傷后，而EGF作為中間反應基因出現時間滯后于TFF2〔3〕，這與本實驗結果一致。同時，國外學者研究發現TFF2與EGF對支氣管上皮細胞增殖、遷移、分化具有協同作用〔12〕，而本實驗中二者在表達部位上具有相似性，均以靠近黏膜肌層陽性細胞居多，同時壁細胞中也可見二者陽性物質的表達。因此推斷TFF2與EGF在潰瘍愈合過程中通過自分泌或旁分泌的方式相互影響，相互作用，共同促進胃黏膜的修復。

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