天然葉黃素添加劑對中華鱉的急性毒性實驗研究

劉海燕 李 超 薛 敏 楊振才

（1.河北師范大學生命科學學院，河北石家莊050024；2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所國家水產(chǎn)飼料安全評價基地，北京100081）

水產(chǎn)動物有著五彩斑斕的體色，正常的體色代表著水產(chǎn)動物的年齡、健康及品質(zhì)。很多水產(chǎn)動物特征性的體色歸功于體內(nèi)類胡蘿卜素的類別及含量，這些類胡蘿卜素不能在動物體內(nèi)從頭合成，必須依賴于外源食物中豐富的類胡蘿卜素的提供[1]。然而，在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖過程中，一些水產(chǎn)動物的正常體色往往容易丟失，帶來很大的經(jīng)濟損失。因此，采取營養(yǎng)調(diào)控手段通過飼料成分的改變來改善體色已成為水產(chǎn)品品質(zhì)調(diào)控的重要內(nèi)容。研究表明，在配合飼料中添加適宜的類胡蘿卜素成為解決這一問題的一種途徑。葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、花卉等綠色植物中的天然類胡蘿卜素，在萬壽菊中的含量最高。一些研究表明，來自萬壽菊的葉黃素可以改善禽類[2]以及黃色系體色水產(chǎn)動物，如：黃顙魚、錦鯉、雜交鯰和金魚[3-6]等魚類皮膚的顏色。中華鱉（Pelodiscus sinensis）是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟動物，其體色為黃色的品質(zhì)受到市場的青睞。然而，人工集約化養(yǎng)殖過程中這種黃色體色的丟失卻降低了商品的價值。迄今為止，葉黃素在中華鱉飼料中的應用還未見報道。急性毒性試驗處在毒理學研究的早期階段，是水產(chǎn)飼料評價的重要參考依據(jù)，在將天然葉黃素應用到中華鱉飼料中之前有必要首先進行天然葉黃素添加劑對中華鱉的急性毒性實驗研究。因此，本文將以中華鱉為研究對象，以天然葉黃素添加劑為受試物，旨在探討天然葉黃素添加劑對中華鱉的急性毒性，為天然葉黃素在中華鱉飼料中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 天然葉黃素添加劑

實驗所用天然葉黃素添加劑（源自萬壽菊）由廣州智特奇生物技術(shù)有限公司提供，為黃色粉末狀物質(zhì)，脂溶性，葉黃素純度為4%。

1.2 中華鱉

實驗所用中華鱉購自石家莊鄧莊中華鱉養(yǎng)殖場，選取當年孵化的中華鱉稚鱉，轉(zhuǎn)入與實驗用水質(zhì)、溫度和光照相同的養(yǎng)殖缸中適應15 d，以使中華鱉適應實驗環(huán)境，每天投喂2次。

1.3 實驗步驟

根據(jù)葉黃素為脂溶性的理化性質(zhì)，依據(jù)GB/T22487—2008[7]，本實驗確定的急性致毒方式為口服急性致毒法，分為單次和連續(xù)口服葉黃素兩個實驗。

1.3.1 單次口服急性毒性實驗

1.3.1.1 實驗設計

由于葉黃素不易溶于水，而且其黏合性及對中華鱉的誘食性均較差，很難單獨給予受試動物，因此本實驗將葉黃素添加劑與中華鱉稚鱉配合飼料混勻后制成小藥丸，投喂給中華鱉。根據(jù)預實驗結(jié)果，不能得到葉黃素添加劑對中華鱉的死亡劑量。因此，正式實驗除了設一個對照組外，另設一個飼料中能最大攙入的添加劑量組，即葉黃素添加劑與對照飼料等量混合，加入一定量的水，制成小藥丸，置于冰箱中備用。對照組飼料的原料組成及主要營養(yǎng)成分見表1中的D1組。本實驗分為對照組和處理組兩個實驗組，每個處理組30個重復。

1.3.1.2 實驗條件

實驗在室內(nèi)靜水系統(tǒng)的玻璃缸中進行，每個玻璃缸（30 cm×60 cm×40 cm）飼養(yǎng)兩只中華鱉，為避免鱉的相互殘殺行為，在缸中用網(wǎng)隔將兩只鱉隔開。缸內(nèi)設有恒溫器和充氧設備，光照采用自然光照加人工光照。使水溫保持在(30±0.5)℃；光周期為14 L∶10 D；每6 h充氧一次，每次30 min，使溶氧保持在5 mg/l以上；每日換水量為1/3，注入已調(diào)好pH值且水溫適宜的水，使pH值保持在8.0±0.5。

表1 實驗飼料配方及營養(yǎng)成分（風干基礎）

在正式實驗之前,將中華鱉稚鱉稱重，選取體重8.0 g左右的稚鱉60只，轉(zhuǎn)入與實驗用水質(zhì)、溫度和光照條件相同的30個玻璃缸中養(yǎng)殖15 d，每天定時投喂對照飼料2次（9：00、18：00）。正式實驗開始時將30個玻璃缸隨機分為兩組（一組為對照組；另一組為實驗組），每組30只中華鱉。中華鱉空腹24 h。受試物的給予方式為自主攝食，受試物制成的小藥丸準確稱重后投喂給中華鱉，投喂半小時后收集殘餌，并進行溶失率的測定，以校正殘餌量，準確計量中華鱉的攝食量。在隨后的14 d觀察期中，中華鱉的飼養(yǎng)管理與馴養(yǎng)期間的相同，詳細觀察并記錄中華鱉的反應情況：行為、攝食、體色等方面的變化，發(fā)現(xiàn)死鱉及時撈出并詳細記錄。

1.3.2 連續(xù)口服急性毒性實驗

1.3.2.1 實驗飼料及實驗設計

根據(jù)單次口服實驗結(jié)果，由于不能求出天然葉黃素添加劑的經(jīng)口急性毒性半致死劑量LD50，在進行連續(xù)口服急性毒性評價時，劑量的設計原則依據(jù)GB/T-22488—2008[8]和歐洲食品安全委員會 (EFSA)[9]靶動物有效性和耐受性試驗規(guī)程，在不影響飼料營養(yǎng)水平的基礎上設計最高劑量組為可能攝入劑量組的10倍以上。因此本實驗設計了5個葉黃素添加劑劑量水平，分別為0（D1）、0.15%（D2）、0.3%（D3）、0.6%（D4）、8%（D5）。5組飼料的原料組成及主要營養(yǎng)成分詳見表1。根據(jù)GB/T23187—2008[10]中的高效液相色譜法實際檢測葉黃素在這5組實驗飼料中的含量分別為1.16(D1)、70.3(D2)、132.0(D3)、239.0(D4)和3 410 mg/kg(D5)。因此本實驗為單因素5個處理水平的設計，每個處理24個重復。粉料先用顆粒機制成直徑為2 mm的軟顆粒，用保鮮盒冷凍保存于-20℃冰箱中備用。

1.3.2.2 實驗鱉及實驗條件

正式實驗開始時，選取120只體質(zhì)健康、體重相近的中華鱉稚鱉，禁食24 h后稱重，隨機分配到60個玻璃缸中。每天定時（9:00、18:00）、定量投喂實驗飼料，記錄每只中華鱉每天的投喂量，同時測定各實驗顆粒料的含水量。殘餌在投喂30 min后用吸管吸出，在鼓風干燥箱中于65℃下烘干至恒重，稱重記錄。在相同的條件下用同樣的方法測定各組飼料的溶失率，對殘餌量進行校正。實驗條件同1.3.1。實驗期為21 d。

1.4 指標計算

攝食率(FI，%)=100×R1/[(Wt+W0)/2]；

飼料系數(shù)(FCR)=R1/(Wt-W0)；

特定生長率(SGR，%/d)=100×[ln(Wt)-ln(W0)]/t；葉黃素日攝入量[mg/(kg bw·d)]=FI×C；

存活率(%)=100×存活魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)。式中：R1——攝食量；

W0——鱉初體重；

Wt——鱉末體重；

t——實驗天數(shù)；

C——葉黃素在飼料中的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用Statistica 6.0軟件進行單因素方差分析（oneway ANOVA）,若數(shù)據(jù)差異顯著則進行Duncan's法多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 單次口服急性毒性實驗

實驗組中華鱉的葉黃素添加劑實際攝入量為18 831 mg/（kg bw），其中葉黃素的實際攝入劑量為753.24 mg/（kg bw）。實驗開始后，實驗期間無論是對照組，還是葉黃素添加劑實驗組[18 831 mg/（kg bw）]中華鱉沒有任何異常反應，其游泳能力、呼吸功能和體色等均未出現(xiàn)異常變化，且每日攝食情況良好，行為安逸，沒有一只中華鱉出現(xiàn)死亡。

2.2 連續(xù)口服急性毒性實驗（見表2）

表2 天然葉黃素添加劑對中華鱉生長性能及飼料利用的影響

由表2可知：實驗期間，所有實驗組及對照組的中華鱉成活率均為100%。中華鱉對天然葉黃素添加劑在5個處理組中的日攝入量分別為：0、14.58、29.32、58.23、801.19 mg/(kg bw·d)；對天然葉黃素的日攝入量分別為：0.01、0.68、1.29、2.32、34.15 mg/(kg bw·d)。

在21 d的連續(xù)攝食葉黃素添加劑后，中華鱉的攝食、生長及飼料利用均未受到顯著影響，各組間的攝食率、飼料系數(shù)和特定生長率均未達到顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

葉黃素是類胡蘿卜素的含氧衍生物，具有很強的抗氧化能力，能夠有效清除體內(nèi)的自由基，對于預防和延緩老年性黃斑退化引起的視力衰退與失眠癥等起著重要作用[11]，在營養(yǎng)和藥用方面有著很大的應用前景，是近年來功能食品領域的研究熱點。目前，對葉黃素安全性的評價已成為葉黃素利用的焦點[12]，相關的急性毒性試驗也有一些研究報道。胡憲等（2009）對大、小鼠進行了葉黃素的急性毒性試驗，結(jié)果表明，大、小鼠急性經(jīng)口LD50＞10 000 mg/kg，認為葉黃素屬無毒物質(zhì)[13]；李大婧等（2008）對由葉黃素和α-亞麻酸組成的軟膠囊進行了安全性毒理學評價，結(jié)果顯示，根據(jù)急性毒性(LD)劑量分級標準，此葉黃素膠囊也屬無毒級[14];Ravikrishnan等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，含67%葉黃素的LutemaxTM2020產(chǎn)品對大鼠的經(jīng)口LD50＞2 000 mg/kg，90 d的最大未觀察到有害作用劑量（NOAEL,no-observed-adverse-effect-level）大于400 mg/(kg bw·d)[12];Kumar等(2009)[15]和Harikumar等(2008)[16]分別在大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，葉黃素90 d的NOAEL為210 mg/(kg bw·d)和400 mg/(kg bw·d)，這些劑量均是實驗中的最大劑量。從以上結(jié)果可以看出，這些純度很高的食品保健級葉黃素經(jīng)毒理學安全評價的結(jié)果是無毒物質(zhì)。

但是，應用于飼料中的天然葉黃素添加劑不同于食品保健級的產(chǎn)品，葉黃素的純度較低。由于在從萬壽菊提取過程中的一些加工工藝要求，葉黃素添加劑中存在著一些載體并殘留著一些化學物質(zhì)，它們是否會對水產(chǎn)動物產(chǎn)生負面影響，這對于將葉黃素添加劑應用到水產(chǎn)動物飼料中是一個值得思考的問題。盡管相關實驗已經(jīng)證明，一定劑量葉黃素添加劑在飼料中的添加可以改善禽類和魚類的體色，也并未產(chǎn)生不良作用[2-6]，但有關葉黃素添加劑的急性毒性實驗還未見報道，其毒性等級尚未知。因此，在本研究中我們采用含4%葉黃素的天然葉黃素添加劑作為中華鱉的受試物來測試葉黃素添加劑可能具有的毒性。

在本文單次口服致毒實驗中，當受試物(葉黃素添加劑)劑量為18 831 mg/(kg bw)時，中華鱉沒有出現(xiàn)一只死亡現(xiàn)象。依據(jù)GB/T 22487—2008《水產(chǎn)飼料安全性評價急性毒性試驗規(guī)程》對受試物的急性毒性分級方法，需根據(jù)LC50或LD50數(shù)值，判定受試物的毒性分級，若水產(chǎn)動物的口服受試物劑量LD50在5 001～15 000 mg/(kg bw)，則判定為實際無毒[7]。因此本試驗中天然葉黃素添加劑對中華鱉經(jīng)口LD50＞18 831 mg/(kg bw)，可以判定本實驗中所用天然葉黃素添加劑為實際無毒物質(zhì)，這與純度很高的食品保健級葉黃素的結(jié)果相一致。在連續(xù)口服致毒實驗中，盡管天然葉黃素添加劑的日攝入量高達801.19 mg/(kgbw·d)，21 d總攝入量為16 824.99 mg/kg時，中華鱉的攝食、生長及飼料轉(zhuǎn)化率均未受到影響。因此，本實驗中天然葉黃素添加劑對中華鱉的21 d NOAEL為大于801.19 mg/(kg bw·d)。

綜上所述，本實驗中所用天然葉黃素添加劑為無毒物質(zhì)，可以添加到中華鱉的飼料中，不會對中華鱉產(chǎn)生毒性作用，但其對體色的改善效果，還需要進一步進行生長實驗研究。

4 結(jié)論

①單次口服急性毒性實驗結(jié)果表明，天然葉黃素添加劑對中華鱉經(jīng)口LD ＞18 831 mg/(kg bw)，為實際無毒物質(zhì)；

②21 d的連續(xù)口服試驗結(jié)果表明天然葉黃素添加劑沒有顯著影響中華鱉的生長與飼料利用，其對中華鱉21 d的NOAEL為大于801.19 mg/(kgbw d)。

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