氯化稀土對(duì)延邊黃牛瘤胃微生物體外發(fā)酵的影響

馮 健 李香子 李玉林 嚴(yán)昌國(guó)

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；2.延邊畜牧開發(fā)集團(tuán)有限公司，吉林延吉 133000)

稀土元素是全部鑭系元素及性質(zhì)相近的釔和鈧17種元素的總稱，常以化合態(tài)存在，天然豐度較低。我國(guó)是世界上稀土資源最豐富的國(guó)家，稀土含量占全球總儲(chǔ)量的76%，居世界之首，已應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、紡織等領(lǐng)域。近年來(lái)，稀土元素作為飼料添加劑在畜牧業(yè)上的研究與應(yīng)用日益廣泛，并取得了良好的效果。王京仁等報(bào)道，奶牛日糧中添加20 mg/kg體重和12.5 mg/kg體重的硝酸稀土可提高日均產(chǎn)乳量、乳脂肪、乳比重。沙里等報(bào)道，肉羊日糧中按每千克體重補(bǔ)飼12 mg的稀土（45%氯化稀土）能夠提高瘤胃內(nèi)TVFA濃度。習(xí)海波等報(bào)道，稀土可改善反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系，使瘤胃保持穩(wěn)定的酸性環(huán)境，各種微生物比例達(dá)到理想狀態(tài)，促進(jìn)瘤胃對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效利用，但高劑量的稀土可破壞瘤胃的緩沖體系，使瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)生異常變化。目前，稀土在反芻動(dòng)物上的應(yīng)用研究諸多，但對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響報(bào)道較少。為了進(jìn)一步探索稀土對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵的影響，本試驗(yàn)利用體外瘤胃微生物發(fā)酵法，通過(guò)添加不同劑量的氯化稀土來(lái)探討其對(duì)延邊黃牛瘤胃發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 體外瘤胃發(fā)酵底物

精料和粗料比為7∶3，精料為玉米，粗料為粉碎的苜蓿草。

1.1.2 供試氯化稀土

由包頭市華商稀土有限公司提供，其主要成分是氧化鑭(La2O3)、氧化鈰(Ce2O3)、氧化釹(Nd2O3),含量分別占稀土氧化物(REO)總量的30.0%、50.0%、14.0%。

1.1.3 人工唾液

發(fā)酵人工唾液根據(jù)McDougall等方法配比:1 L人 工唾液含 5 880 mg NaHCO3、5 580 mg Na2HPO4、340 mg KCl、36 mg MgCl2、282 mg NaCl。配制完成后，進(jìn)行全自動(dòng)高壓滅菌，最后調(diào)整pH值至6.5。

1.1.4 瘤胃液供體動(dòng)物及其飼養(yǎng)與瘤胃液的采集

試驗(yàn)動(dòng)物為3只安裝有永久性瘤胃瘺管的延邊黃牛,體重(400±23.5)kg。飼喂日糧精粗比為60∶40，即精料補(bǔ)充料6 kg/d和苜蓿草4 kg/d，每天飼喂2次（7：00和17：30），自由飲水。在早飼后2 h從3只延邊黃牛瘤胃的前、中、后不同位點(diǎn)采集足量瘤胃食糜，充分?jǐn)嚢韬笙扔盟膶蛹啿歼^(guò)濾，再用12層紗布過(guò)濾，至預(yù)熱過(guò)處理的收集瓶中，CO2恒溫培養(yǎng)箱39.0℃下培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理（0、500、1 000、2 000 mg/kg），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)時(shí)間12 h，氣體測(cè)定時(shí)間為3、6、9、12 h，其他指標(biāo)測(cè)定時(shí)間為0、3、6、12 h。

1.3 體外培養(yǎng)程序

分別稱取1.4 g精料、0.6 g粗料放入發(fā)酵瓶；氯化稀土按4個(gè)濃度水平0、500、1 000、2 000 mg/kg分別添加；加入瘤胃緩沖液30 ml，瘤胃液60 ml（二者體積比為1∶2），混勻。置于39℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 培養(yǎng)液pH值的測(cè)定

pH值的測(cè)定使用雷磁pHS-3CpH計(jì)，在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定體外培養(yǎng)液的pH值。

1.4.2 產(chǎn)氣量的測(cè)定

根據(jù)各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)得到的樣品產(chǎn)氣壓力轉(zhuǎn)成產(chǎn)氣體積，通過(guò)空白對(duì)照，校正產(chǎn)氣量，計(jì)算累積產(chǎn)氣量。

1.4.3 氨態(tài)氮(NH3-N)的測(cè)定

氨態(tài)氮（NH3-N）的測(cè)定采用靛酚比色法。

1.4.4 瘤胃揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的測(cè)定

揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測(cè)定方法參照Li等方法，用Agilent TechnologiesGC-7890A氣象色譜儀，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定，F(xiàn)ID(Flame Ionization Detector)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱型號(hào)Agilent 19091F-112，240 ℃，25 m×320 μm×0.5 μm。

1.4.5 氣體（CO2、CH4、H2）的測(cè)定

用島津GC-2014C氣相色譜儀參考Callaway等方法，用島津GC-2014C氣相色譜儀進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定，TCD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱型號(hào)：Hayesep Q，2 m×4 mm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量氯化稀土對(duì)pH值的影響（見表1）

表1 不同發(fā)酵時(shí)間氯化稀土對(duì)瘤胃液pH值的影響

由表1可以看出，對(duì)照組與試驗(yàn)組的pH值隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，但各處理組和對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 不同劑量氯化稀土對(duì)瘤胃發(fā)酵液產(chǎn)氣量的影響

2.2.1 不同劑量氯化稀土對(duì)總產(chǎn)氣量的影響（見表2）

表2 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)氯化稀土對(duì)瘤胃液總產(chǎn)氣量的影響(ml)

由表2可見，對(duì)照組和試驗(yàn)組瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的總產(chǎn)氣量都隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加;各處理組的產(chǎn)氣量均高于對(duì)照組，3 h時(shí)500 mg/kg處理組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），其他各組間差異不顯著(P＞0.05)；6～12 h時(shí)間段，500 mg/kg處理組的產(chǎn)氣量與對(duì)照組、2 000 mg/kg組相比差異顯著(P＜0.05)，9 h時(shí)500 mg/kg處理組與1 000 mg/kg組相比差異顯著（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2.2 不同劑量氯化稀土對(duì)CO2、CH4、H2含量的影響(見表3～表5)

表3 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)氯化稀土對(duì)瘤胃液中CO2含量的影響(μmol)

表4 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)氯化稀土對(duì)瘤胃液中含量的影響(μmol)

表4 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)氯化稀土對(duì)瘤胃液中含量的影響(μmol)

?

表5 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)氯化稀土對(duì)瘤胃液中H2含量的影響(μmol)

從表3可以看出，對(duì)照組與試驗(yàn)組瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的CO2量都隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，各處理組與對(duì)照組相比呈上升趨勢(shì)。3 h時(shí)500 mg/kg處理組CO2含量與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），1 000、2 000 mg/kg組與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)，處理組500 mg/kg與1 000、2 000 mg/kg處理組間差異顯著(P＜0.05)；6～9 h時(shí)間段各處理組與對(duì)照組相比，以及各處理組之間差異均不顯著(P＞0.05)，12 h時(shí)1 000 mg/kg組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，500、2 000 mg/kg處理組與對(duì)照組相比差異不顯著,氯化稀土添加組之間差異不顯著(P＞0.05)。總體試驗(yàn)結(jié)果表明，氯化稀土對(duì)CO2產(chǎn)生有影響。

對(duì)照組與試驗(yàn)組瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的CH4含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；但各處理組與對(duì)照組，以及處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。

對(duì)照組與試驗(yàn)組瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的H2含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,各處理組與對(duì)照組相比呈上升趨勢(shì)。3～6 h時(shí)各組之間差異不顯著(P＞0.05)；9～12 h時(shí)500 mg/kg組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），12 h時(shí)2 000 mg/kg組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），其余各組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同劑量氯化稀土對(duì)揮發(fā)性脂肪酸含量的影響（見表6）

由表6可見，試驗(yàn)組和對(duì)照組的總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加;其中3 h時(shí)，2 000 mg/kg處理組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；12 h時(shí)1 000 mg/kg和2 000 mg/kg組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），6 h時(shí)差異不顯著(P＞0.05)。通過(guò)本試驗(yàn)看出，在體外瘤胃微生物發(fā)酵下，添加氯化稀土對(duì)TVFA有提高趨勢(shì)。

表6 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)氯化稀土對(duì)瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，乙酸濃度均有不同程度的升高，在3 h時(shí)2 000 mg/kg處理組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，其他氯化稀土組和對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)。6 h時(shí)各組間乙酸濃度差異不顯著(P＞0.05)。12 h時(shí)氯化稀土處理組與對(duì)照組相比乙酸濃度差異顯著(P＜0.05)，500 mg/kg處理組和2 000 mg/kg組相比乙酸濃度差異顯著（P＜0.05），其余各處理組間差異不顯著。氯化稀土處理組與對(duì)照組相比，以及氯化稀土添加組之間丙酸含量差異不顯著(P＞0.05)。丁酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比略有升高，但差異不顯著（P＞0.05）。

表6結(jié)果顯示，各添加氯化稀土處理組和對(duì)照組相比，乙酸丙酸比率呈上升趨勢(shì)。3～6 h時(shí)間段差異不顯著(P＞0.05)；12 h時(shí)1 000、2 000 mg/kg組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。由此看出，添加氯化稀土影響了瘤胃發(fā)酵的乙酸丙酸比率。

2.4 不同劑量氯化稀土對(duì)瘤胃發(fā)酵液氨氮含量的影響(見表7)

由表7可見，氯化稀土各處理組與對(duì)照組相比瘤胃發(fā)酵液中氨氮含量在0～12 h時(shí)間內(nèi)呈上升趨勢(shì)。3 h時(shí)差異不顯著（P＞0.05）;在6～12 h時(shí)間段，各處理組與對(duì)照組相比呈下降趨勢(shì)，500、1 000 mg/kg組與對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.05)，2 000 mg/kg組與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)；6 h時(shí)2 000 mg/kg組與500、1 000 mg/kg相比差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明添加氯化稀土能夠降低氨氮含量，但在所設(shè)定濃度范圍內(nèi)效果不明顯。

表7 不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)氯化稀土對(duì)瘤胃液NH3-N含量的影響(mg/100 ml)

3 討論

3.1 氯化稀土對(duì)發(fā)酵液pH值的影響

劉江波等研究表明，添加稀土對(duì)瘤胃液體外發(fā)酵pH值顯著降低。但許多資料表明，稀土對(duì)瘤胃液pH值無(wú)影響，本研究結(jié)果顯示，瘤胃液在經(jīng)歷了12 h發(fā)酵后，pH值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨著時(shí)間的推移均呈下降趨勢(shì)，但各處理組之間差異不顯著。pH值的下降，可能是由于靜態(tài)發(fā)酵，使得TVFA的累積造成的。

3.2 氯化稀土對(duì)產(chǎn)氣量的影響

瘤胃內(nèi)的氣體主要為二氧化碳、甲烷，另外還有少量的氮?dú)狻錃狻Ｆ渲屑淄楹繛?8.8%左右。產(chǎn)氣量越高，瘤胃內(nèi)的發(fā)酵活動(dòng)越劇烈，對(duì)反芻動(dòng)物的促進(jìn)作用越明顯。Menke等發(fā)現(xiàn)，飼料樣品在體外發(fā)酵24 h的產(chǎn)氣量與瘤胃內(nèi)有機(jī)物降解率呈顯著的正相關(guān)。Yang等發(fā)現(xiàn)，添加稀土能夠提高瘤胃中有機(jī)物的消化率。本試驗(yàn)中各處理組產(chǎn)氣量均高于對(duì)照組，這說(shuō)明氯化稀土能夠提高有機(jī)物降解率。另外，本試驗(yàn)產(chǎn)氣量隨著氯化稀土添加水平的增加而減少，說(shuō)明適宜濃度的稀土元素有益于微生物生長(zhǎng)，但提高稀土元素的濃度，對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。這與Uezu等、Valluzzi等、Zhuang等的報(bào)道相一致。

3.3 氯化稀土對(duì)CO2、CH4及H2含量的影響

反芻動(dòng)物在通過(guò)微生物發(fā)酵利用其它動(dòng)物不能利用的纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物的過(guò)程中產(chǎn)生大量的CO2和H2。本試驗(yàn)中二氧化碳和氫氣含量升高，說(shuō)明氯化稀土能夠提高纖維素的利用率，這與Ortega等報(bào)道的稀土可以促進(jìn)瘤胃纖維素類物質(zhì)消化的結(jié)果相一致。

甲烷菌生成甲烷的路徑有以下幾種:①以H2和CO2為底物生成甲烷（4H2+CO2—CH4+2H2O）；②利用甲醇和甲胺轉(zhuǎn)化成甲烷；③通過(guò)乙酸發(fā)酵產(chǎn)生甲烷。

Wolin等、Moun等研究結(jié)果表明，在這3種途徑中，以H2和CO2為底物生成甲烷為主。本試驗(yàn)中甲烷無(wú)顯著變化，二氧化碳和氫氣含量升高。這說(shuō)明當(dāng)CH4生成受到抑制時(shí)，引起H2和CO2的累積。這也是本試驗(yàn)中H2和CO2含量升高的原因之一。

3.4 不同劑量的氯化稀土對(duì)瘤胃VFA濃度的影響

桂榮等報(bào)道，添加0.02%稀土飼喂絨山羊，稀土組瘤胃液總VFA及乙酸占總酸的比值分別比對(duì)照組高7.24%和33.50%；本試驗(yàn)在體外高精料日糧條件下，以及在所設(shè)定濃度范圍內(nèi)氯化稀土提高了總揮發(fā)性脂肪酸和乙酸的濃度，這與上述報(bào)道中稀土對(duì)總酸和乙酸的影響相一致；但氯化稀土對(duì)丙酸和丁酸含量無(wú)顯著影響。劉強(qiáng)報(bào)道，添加氯化鑭飼喂中國(guó)西門塔爾牛閹牛，瘤胃乙酸、丁酸濃度沒有顯著變化，但丙酸和總酸含量顯著高于對(duì)照組。劉江波等報(bào)道的在南江黃羊瘤胃體外發(fā)酵中添加不同水平的氯化鈰，總酸、乙酸、丙酸、丁酸均顯著高于對(duì)照組。這可能由于選擇添加的稀土和供試動(dòng)物以及添加劑量不同而引起的差異。

陳喜斌等發(fā)現(xiàn)，瘤胃24 h可發(fā)酵有機(jī)物與瘤胃VFA產(chǎn)量、ADF降解量與乙酸產(chǎn)量、中性洗滌劑溶解物的降解量與丙酸產(chǎn)量具有較高的正相關(guān)。本試驗(yàn)中氯化稀土提高了乙酸的濃度，這說(shuō)明氯化稀土能夠促進(jìn)日糧ADF的降解。

3.5 不同劑量的氯化稀土對(duì)瘤胃內(nèi)NH3-N濃度的影響

Satter等試驗(yàn)的結(jié)果表明，NH3-N的濃度小于2.50 mg/100 ml時(shí)，發(fā)酵的“解偶聯(lián)”作用引起微生物產(chǎn)量降低，生產(chǎn)效率下降，該值被廣泛用作瘤胃最低NH3-N濃度標(biāo)準(zhǔn);相關(guān)研究認(rèn)為，瘤胃微生物依靠NH3-N而生長(zhǎng)，且需要一個(gè)適宜的水平，其最佳NH3-N濃度為6.3～27.5 mg/100 ml。本試驗(yàn)中，3 h后各組NH3-N濃度均在這個(gè)范圍內(nèi)，這說(shuō)明各組瘤胃微生物均能夠正常生長(zhǎng)。桂榮等在絨山羊日糧中添加0.02%的硝酸稀土(混合物),發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組瘤胃內(nèi)NH3-N濃度顯著低于對(duì)照組。于靜給綿羊日糧中添喂216.49 mg/kg硝酸稀土（混合物），發(fā)現(xiàn)微生物利用NH3-N的程度顯著提高。本研究也發(fā)現(xiàn)，6～12 h添加氯化稀土的500、1 000 mg/kg組NH3-N濃度顯著低于對(duì)照組，這可能是因?yàn)橄⊥量梢蕴岣吡鑫竷?nèi)氨氮的利用效率所致。

4 結(jié)論

通過(guò)添加不同劑量的氯化稀土對(duì)延邊黃牛瘤胃微生物體外發(fā)酵的測(cè)定和分析，表明氯化稀土能夠提高瘤胃液中TVFA、乙酸濃度，提高了VFA中乙酸/丙酸的比值，降低瘤胃液中氨氮濃度，同時(shí)提高了總產(chǎn)氣量、二氧化碳產(chǎn)量。因此，氯化稀土在體外條件下，可以在一定程度上提高延邊黃牛的瘤胃微生物發(fā)酵功能，并以1 000 mg/kg添加量較為適宜。

（參考文獻(xiàn)25篇，刊略，需者可函索）