惡性腫瘤患者外周血調節性T細胞及Th1、Th2細胞的檢測和臨床意義

張瑞萍 徐冰心 王社論 鄭成中 董青 翟樹森 周學慧 高云閣

（解放軍第306醫院腫瘤科，a特種病科，b兒科，北京 100101）

腫瘤的發生、發展與機體的免疫狀態密切相關。T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞是機體抗腫瘤免疫的主要效應細胞。腫瘤患者體內存在多種類型的免疫抑制細胞，其中CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg細胞）是對正向免疫應答（包括B細胞、T細胞、抗原遞呈細胞等參與的免疫應答）起負向調控作用的CD4＋的T細胞亞群[1]。研究表明，腫瘤患者外周血中Treg細胞的數量增多，這提示Treg細胞的免疫抑制作用可能與實體瘤的發生、發展關系密切[2－3]。分泌IFN-γ的CD4＋T細胞為 Th1細胞，分泌IL-4的CD4＋T細胞為Th2細胞。正常機體的Th1／Th2細胞處于動態平衡，這對維持機體的免疫功能至關重要。本研究通過流式細胞儀檢測惡性腫瘤患者及健康人群外周血中的淋巴細胞亞群、Treg細胞數量以及Th1、Th2細胞，旨在了解惡性腫瘤患者的免疫狀態。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年1月—2012年1月在解放軍第306醫院住院的經病理明確診斷為惡性腫瘤的患者90例（腫瘤組），其中男性48例，女性42例；年齡35～83歲，中位年齡（52.2±3.5）歲；乳腺癌12例，肺癌26例，結直腸癌20例，頭頸癌5例，食管癌4例，婦科腫瘤9例，胃癌5例，腎癌5例，肝癌4例。腫瘤組患者在本研究前1個月均無化療、放療史，且近3個月未應用免疫制劑，無發熱及輸血史。另選擇健康體檢者60例作為對照組，其中男性35例，女性25例；年齡30～78歲，中位年齡（50.4±5.6）歲。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 檢測外周血Treg細胞所需的試劑：小鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體以及小鼠抗人CD25-APC單克隆抗體均購自美國BD公司，小鼠抗人 FoxP3-PE單克隆抗體、大鼠IG2α-PE、固定／破膜濃縮劑購自G-Biosciences公司。檢測T淋巴細胞內Th1、Th2細胞因子所需的試劑：佛波酯（phorbol-12-myristate 13-acetate，PMA）、離 子 霉素、布雷菲得菌素（brefeldin-A，BFA）、小鼠抗人CD4-APC單克隆抗體、小鼠抗人IFN-γ／IL-4單克隆抗體、小鼠抗人γ2α-FITC單克隆抗體以及小鼠抗人γ1-PE單克隆抗體均購自美國BD公司。采用BD公司生產的Multi-test IMK四色免洗淋巴細胞亞群分析試劑盒檢測T淋巴細胞亞群，A劑為BD Multi-test CD3-FITC／CD8-PE／CD45PERP／CD4-APC，B劑為 BD Multi-test CD3-FITC／CD16PE＋56-PE／CD45P ERP／CD19-APC。

1.2.2 主要儀器 流式細胞儀購自美國BD公司，CO2培養箱購自美國Forma scientific公司，離心機購自德國KENDRO公司，渦旋混勻器購自IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 淋巴細胞亞群檢測方法 用5 mL肝素鈉抗凝負壓真空采血管采集受試者空腹靜脈血2 mL，在4 h內進行檢測。配置溶血素備用。取兩個管，分別標記為A、B管，各加入100μL全血，再分別加20μL A劑、B劑于A、B管中，混勻，室溫避光20 min。在A管、B管中均加入1000μL溶血素，混勻，室溫避光15 min后采用流式細胞儀檢測，軟件自動分析得出結果。

1.3.2 T淋巴細胞內IFN－γ、IL-4細胞因子的檢測方法 用肝素鈉抗凝管采集靜脈血2 mL，取500 μL全血，依次加入稀釋后PMA5μL（1μg／mL）、離子霉素1μL（1μg／mL）、BFA1μL（10μg／mL），然后置于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養5 h，以刺激淋巴細胞。取200μL刺激后的血細胞加固定／破膜稀釋液（成分為 Triton X-100）1 mL，混勻后4℃避光放置30 min，然后離心，棄上清液。破膜后在各管中依次加入5μL CD4-APC抗體、小鼠抗人IFN-γ／IL-4單克隆抗體，而在同型管中加入相應同型對照，各管均加20μL。低速渦旋混勻后，4℃避光放置30 min，隨后采用流式細胞儀檢測。

1.3.3 外周血中Treg細胞的檢測方法 在實驗管和同型對照管中各加入100μL外周全血，再加入20μL CD4-FITC以及5μL CD25-APC，混勻后室溫避光放置15～20 min，然后加入固定／破膜稀釋液1 mL，4℃避光放置30 min后，離心并棄上清液。在抗體管中加入5μL胞膜內結合的免疫熒光Foxp3-PE抗體，在對照管中加入IgG2α抗體，避光放置30 min，然后用流式細胞儀檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計分析，數值用均數±標準差（）表示，驗證兩樣本資料符合正態分布且方差齊性后采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 腫瘤組及對照組外周血淋巴細胞亞群以及Treg細胞的分布 腫瘤組患者外周血CD3＋、CD4＋、NK細胞比例均顯著低于對照組（P＜0.05），而前者的Treg細胞比例則顯著高于后者（P＜0.05），驗證兩組資料方差齊性后采用t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 腫瘤組及對照組外周血淋巴細胞亞群、Treg細胞的分布（，%）

表1 腫瘤組及對照組外周血淋巴細胞亞群、Treg細胞的分布（，%）

注：＊腫瘤組與對照組比較，P＜0.05

組別 n CD3＋T細胞＊ CD4＋T細胞＊ CD8＋T細胞 NK細胞＊ B細胞 Treg細胞＊腫瘤組 90 67.80±10.1234.21±10.0233.58±12.30 19.89±7.09 9.12±2.63 9.64±5.2107對照組 60 74.11±10.3239.02±11.0134.12±12.30 22.03±16.0811.21±6.32 3.65±1.

圖1 腫瘤組及對照組Treg細胞的表達

2.2 惡性腫 瘤患者外 周血IFN－γ／CD4＋、IL-4／CD4＋T細胞的數量 如表2所示，惡性腫瘤患者外周血IL-4／CD4＋T細胞數量顯著高于對照組，而IFN-γ／CD4＋T細胞數量顯著低于對照組，驗證兩組資料方差齊性后采用t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 腫瘤組及對照組IFN－γ／CD4＋、IL-4／CD4＋的表達（，%）

表2 腫瘤組及對照組IFN－γ／CD4＋、IL-4／CD4＋的表達（，%）

組別 n IFN-γ／CD4＋ IL-4／CD4＋02對照組 60 13.89±2.13 2.03±0.28 P值 P＜0.05 P＜0.腫瘤組 90 9.37±3.07 4.35±2.05

3 討 論

機體的免疫功能在抗腫瘤免疫應答中起著重要的作用。本研究發現，惡性腫瘤患者外周血CD3＋T細胞、CD4＋T細胞和NK細胞的比例均顯著低于對照組（P＜0.05），而Treg細胞的比例顯著高于對照組，這表明惡性腫瘤患者的抗腫瘤免疫功能嚴重受損。

早在20世紀70年代初期，Gershon等[4]明確提出了抑制性T細胞的概念。1995年Sakaguchi等[5]的研究表明，IL-2受體的α鏈即CD25分子可作為抑制性T細胞的表型，并明確提出了調節性T細胞（Treg細胞）的概念。此后，出現了Treg細胞的研究熱潮。Curiel等[6]研究發現，腫瘤局部Treg細胞數量顯著增多，且腫瘤局部Treg細胞的數量與腫瘤的進展和預后密切相關。腫瘤局部的Treg細胞主要通過4種機制抑制免疫效應細胞（如T細胞、NK細胞和樹突狀細胞）的功能：（1）通過Treg細胞表面的CTLA-4分子下調樹突狀細胞（DC）表面的重要的共刺激分子CD80／86，從而抑制DC的成熟和抗原呈遞功能，間接抑制T細胞的活化；（2）通過分泌穿孔素和顆粒酶，直接殺傷DC和T細胞；（3）通過分泌抑制性的細胞因子IL-10和 TGF-β，廣譜抑制抗原特異性T細胞、B細胞及抗原提呈細胞（APC）等；（4）通過干擾細胞代謝，影響效應細胞的功能[7]。目前，腫瘤的免疫治療在腫瘤的綜合治療中發揮著越來越重要的作用，Treg細胞的深入研究為腫瘤免疫治療提供了新的思路。本研究發現，腫瘤患者外周血Treg細胞數量較健康人顯著增多，說明腫瘤患者的抗腫瘤免疫功能處于抑制狀態。

腫瘤特異性的細胞免疫和體液免疫應答均需要Th的參與。Th1細胞主要介導細胞免疫，而Th2細胞介導體液免疫。Sharma等的[8]研究表明，Th1細胞分泌的IFN-γ具有較強的抗腫瘤和免疫調節作用，IFN-γ可以誘導NK細胞，增強其抗腫瘤活性，抑制某些腫瘤的生長。如果機體Th1型細胞占優勢，說明機體處于良好的抗腫瘤狀態。Th2細胞分泌的IL-4可促進腫瘤組織產生IL-10，抑制APC的功能；IL-4還可通過抑制IL-12和IFN－γ的產生、抑制NK細胞的活化、減少腫瘤細胞抗原的表達等來抑制細胞免疫的抗腫瘤效應。體內Th1和Th2兩個細胞亞群相互作用，互相拮抗，維持著相關細胞因子的動態平衡。而當Th1和Th2兩個細胞亞群發生平衡失調，即所謂的Th1／Th2漂移，就會導致機體免疫調節功能的紊亂。本研究采用流式細胞儀檢測 了 腫 瘤 患 者 外 周 血 中 IFN-γ／CD4＋、IL-4／CD4＋的表達量，發現惡性腫瘤患者存在顯著的Th1向Th2漂移，說明腫瘤患者的抗腫瘤免疫受到嚴重干擾。

綜上所述，本研究發現惡性腫瘤患者存在免疫功能紊亂，其外周血中抗腫瘤免疫細胞CD3＋T細胞、CD4＋T細胞和NK細胞的比例均顯著低于健康人，而其外周血中的Treg細胞則較健康人顯著增多，且存在Th1向Th2漂移，三者的協同作用導致腫瘤患者的抗腫瘤功能減弱及免疫逃逸。如何清除或下調Treg細胞、維持免疫細胞的平衡以及促使Th2向Th1逆轉對重建機體的抗腫瘤免疫功能有重要的意義。

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[4]Gershon RK，Kondo K.Cell interactions in the induction of tolerance：the role of thymie lymphoeytos[J].Immunology，1970，18（5）：723-737.

[5]Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains（CD25）.Break down of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol，1995，155（3）：1151-1164.

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[7]Sakaguchi S，Yamaguchi T，Numura T，et al.Regulatory T cell and immune tolerance[J].Cell，2008，133（5）：775-780.

[8]Sharma A，Rajappa M，Satyam A，et al.Cytokines（TH1 and TH2）in patients with advanced cervical cancer undergoing neoadjuvant chemoradiation：correlation with treatment response[J].Int J Gynecol Cancer，2009，19（7）：1269-1275.