肺炎支原體的分離鑒定與藥敏性研究

劉展 袁春麗 李青鳳 汪水城 王本旭

（1.北京市懷柔區婦幼保健院，北京 101400；2.北京軍區疾病預防控制中心，北京 100042）

支原體肺炎是肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）引起的肺炎。支原體肺炎起病緩慢，患者有發熱、陣發性刺激性咳嗽、少量黏液性或黏液膿性痰。支原體肺炎多發于青少年，患病率占肺炎的15%～30%[1]。目前臨床治療支原體肺炎的常用藥物包括阿奇霉素、紅霉素等[2]。本研究旨在通過探討MP臨床分離株對臨床常用抗生素的敏感性，為臨床治療支原體肺炎提供用藥依據。

1 資料與方法

1.1 材料 乳糖酸阿奇霉素（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，0.25 g，25萬 U／瓶），頭孢呋辛鈉（Esseti Farmaceutici s.r.l，Italy，0.75 g／瓶），頭孢曲松鈉（上海羅氏制藥有限公司，0.5 g／瓶），青霉素（石家莊制藥集團有限公司，1 g／瓶）；美洛西林（華北制藥有限公司，1 g／瓶）；乳糖酸紅霉素（湖南中南科倫藥業有限公司，0.25 g／瓶）；支原體培養基CM0401、CM0403、SR0059和 SR0060C（Oxoid公司，United Kingdom）；核酸分子量標準 DL2000 DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 雙向培養基制備 100 mL蒸餾水中加入3.55 g CM0401，121℃高壓滅菌15 min，每個15 mL培養管中加入1 mL滅菌后的CM0401培養基，自然凝固。取1支SR0060C，加入20mL蒸餾水溶解。向每個培養管中加入2 mL SR0060C，4℃保存備用。

1.2.2 咽拭子標本選擇性培養與鑒定 將咽拭子標本浸入雙向培養基中，37℃培養2周左右。當培養基顏色由紅色轉變為橙黃色時，將培養液于MP固體培養（CM0403＋SR0059＋瓊脂粉）上劃板培養，直至鏡下看到“油煎蛋”樣菌落長成為止。挑取菌落于雙相培養基中繼續培養，觀察培養基顏色變化。

1.2.3 MP的PCR鑒定方法 支原體核酸提取方法參照 DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen，Cat No：69504）說明書進行。引物參照文獻[3]設計如下：上游引物為5’—GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3’；下 流 引 物 為 5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCT-3’。反 應 條 件為94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s；28個循環；72℃處理10 min。擴增片斷長度為280bp。以正常雙向培養基為陰性對照。

1.2.4 MP藥敏性實驗 將MP分別與終濃度為5 mg／mL、1 mg／mL、100μg／mL、10μg／mL、5μg／mL和1μg／mL的阿奇霉素、紅霉素、頭孢呋辛鈉、頭孢曲松鈉、氨芐青霉素和美洛西林鈉共同培養，觀察培養基顏色的改變。待某2個濃度間培養基顏色出現變化后，進一步稀釋至合適的藥物濃度。陰性對照不加任何抗生素。

2 結 果

經過多輪特異的選擇性的雙相培養基篩選，成功分離到1株MP，該支原體能夠特異性地生長在雙相培養基中，而且符合雙相培養基顏色變化。提取MP核酸，經過PCR擴增，得到280 bp特異擴增帶，與預期結果一致。見圖1。

圖1 MP的PCR擴增鑒定結果

當阿奇霉素、紅霉素、頭孢呋辛鈉終濃度分別稀釋至31μg／mL、125μg／mL、500μg／mL時，MP培養基顏色不變，隨著抗生素濃度降低，MP培養基顏色會逐漸由紅色變為橙黃色。而頭孢曲松鈉、美洛西林鈉和氨芐青霉素在不同濃度下培養基顏色都由紅色變為橙黃色。MP在不同濃度抗生素的雙相培養基中顏色的相對變化指示見表1。

表1 MP于不同濃度抗生素中培養基顏色變化情況

3 討 論

MP是介于細菌與病毒之間的一種微生物，是可獨立生活的最小生物個體，可吸附于呼吸道上皮細胞表面并破壞細胞表面，產生過氧化氫引起肺部組織損傷，引發一系列的病理免疫反應[4]。關于臨床治療支原體肺炎時各種抗生素針對MP的有效抑制濃度，目前鮮有報告。

分離MP比較困難，主要原因之一是其生長和增殖速度非常慢，在固體瓊脂培養板上需要生長兩周以上才能在鏡下看到菌落。本研究采用Oxoid公司生產的對MP具有選擇性篩選作用的培養基進行初步培養與篩選，然后通過支原體種屬特異性引物進行PCR擴增鑒定，分離到了1株MP臨床株。

本研究顯示，阿奇霉素對MP的有效抑制濃度為31μg／mL，而紅霉素最低有效抑制濃度為125 μg／mL。這說明該株MP對阿奇霉素較敏感，對紅霉素出現了一定的抗藥性，故臨床治療支原體肺炎時應首選阿奇霉素，而非紅霉素。

本研究發現，頭孢呋辛鈉對MP具有一定的抑制作用，其最低抑制濃度為500μg／mL。本研究結果首次證實了頭孢呋辛鈉能夠有效抑制MP的生長。但同為β－內酰胺類抗生素的頭孢曲松鈉、美洛西林以及氨芐青霉素對MP生長卻無抑制作用，其原因有待進一步研究。

[1]陳玲玲，成云改，陳志敏，等.肺炎支原體肺炎患兒混合感染的研究[J].中華兒科雜志，50（3）：211-215.

[2]童海燕.重癥支原體肺炎56例治療分析[J].中國臨床醫學，2010，17（5）：661-662.

[3]李淳，吳移謀，朱翠明，等.PCR及RT-PCR檢測咽拭子標本肺炎支原體的比較[J].中國人獸共患病學報，2012，28（2）：127-130.

[4]陳志敏.肺炎支原體肺炎的再認識—從發病機制到臨床治療的探討[J].中國實用兒科雜志，2012，27（4）：253-257.