云南省精神分裂癥患者關聯基因檢測*

任玉霞，周小龍，張海燕，高恒亮，陳繼峰#

1)鄭州大學生物工程系 鄭州 450001

2)甘肅亞盛集團博士后科研工作站北京分站 北京 100101

精神分裂癥是以基本個性、思維、情感和行為的分裂，精神活動與環境不協調為主要特征的一類最常見的精神疾病，是多基因遺傳病[1-2]。近年來有一些報道[3-5]表明，谷氨酸能功能失調與精神分裂癥相關，如親離子型谷氨酸受體NR1、NR2A、KA1、GluR7及一些代謝型谷氨酸能受體亞單位mGluR3、GRID1等都與神經突觸可塑性相關。此外，調節性G蛋白信號4、神經調節蛋白1、右旋氨基酸氧化酶(DAO)與DAO激活劑(DAOA)也與精神分裂癥相關。根據目前與谷氨酸能受體系統相關基因在精神分裂癥遺傳學方面的研究及谷氨酸能功能不平衡假說的研究[6]，作者選擇了谷氨酸遞質系統中的4個基因的4個 SNPs位點即:mGluR3基因 GRM3(位點rs2299225)、NR1 基因 GRIN1(位點 rs11146020)、GRID1基因(位點rs2814351)和DAOA基因G72/G30(位點rs778293)進行了研究，觀察以上位點與精神分裂癥的關聯性。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣本來源 HotMaster酶、dNTPs均由北京天根公司提供，所有引物均由北京奧科生物技術有限公司合成，核酸外切酶Ⅰ與蝦堿性磷酸酶(SAP)購自 Fermentas公司，biotin-14-dCTP與 TSP酶購自Invitrogen公司，dATP、dGTP、dTTP購自寶生物工程有限公司，堿性磷酸酶鏈霉親和素購自北京鼎國生物技術有限公司，去離子甲酰胺為Sigma公司生產，BCIP/NBT購自Amresco公司。病例組及對照組血樣來自云南省紅河精神病院。兩組樣本DNA的提取由云南大學完成。病例組樣品共255個，其中女性80個，男性175個，患者年齡27～55(41.4±10.0)歲。對照組樣品共262個，其中女性101個，男性161個，對照年齡26～57(40.3±10.0)歲。所有患者均符合美國精神障礙診斷與統計手冊第4版(DSM2Ⅳ)精神分裂癥的診斷標準，排除合并嚴重器質性疾病及精神活性物質濫用者。對照者均排除精神疾病，且家族中無精神疾病及自殺者，個體間無血緣關系。

1.2 引物設計 針對每個SNP設計一對PCR引物(PF/PR)、一對等位基因特異性引物延伸(allelespecific primer extension，ASPE)引物(其 5’端 24 個堿基為標簽tag序列)和一對反義標簽(anti-tag)。tag與anti-tag選自美國Luminex公司的一套設計，為互補序列，長度均為24個堿基。全部引物和標簽的名稱及序列見表1。

表1 引物和標簽序列

1.3 SNP位點的擴增

1.3.1 PCR 以總基因組為模板，PCR擴增包含SNP位點的 DNA片段。PCR反應體系50 μL，含1 × PCR Buffer，dNTPs 0.2 mmol，引物 PR、PF 各 0.2 μmol，HotMaster酶2.5 U，DNA 40 ng。反應條件:94℃預變性10 min;94℃變性40 s，54℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個循環;72℃延伸10 min;4℃保存。取PCR擴增產物5 μL，行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 ASPE反應 在ASPE反應之前，先用核酸外切酶Ⅰ9 U和SAP 4.5 U對上述PCR產物進行處理;反應條件為37℃ 20 min，80℃ 20 min;反應體系為 100 μL，含 dATP、dGTP、dTTP 各 5 μmol，模板為上步 PCR 反應產物 45 μL，biotin-14-dCTP 3.2 μmol，TSP 酶 2.5 U，10 × PCR Buffer 5.5 μL，Mg2+0.75 mmol。ASPE反應條件:96℃預變性2 min;94℃變性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環;4℃保存。產物純化:在ASPE反應產物中加200 μL 預冷無水乙醇，3 mol/L NaAC 10 μL 于 －80℃ 30 min離心后棄上清;加500 μL體積分數70%乙醇，再離心棄上清;用體積分數70%乙醇清洗，吹干后加40 μL雙蒸水溶解。

1.4 雜交及基因分型 參照Koo等[7]的方法建立了簡易微陣列法。取4個位點的anti-tag溶液0.5 μL(100 μmol/L)，固定在醋酸纖維素膜上，加預雜交液2.5 mL，37℃預雜交2 h;換雜交液(去除鮭魚精的預雜交液)2.5 mL，40 μL ASPE 反應產物，37℃雜交 4 h;用洗滌液 1(0.1 × SSC，pH7.0，1 g/L SDS)于37℃洗滌4次，每次10 min;用蒸餾水淋洗1 遍后加入封閉液(20 g/L BSA，0.1 mol/L NaCl，12 g/L Triton-100，0.1 mol/L Tris-HCl pH7.5)3 mL，封閉1 h;加入堿性磷酸酶鏈霉親和素(1.0 g/L)3 μL，37℃孵育 30 min;加入洗滌液 2(0.1 mol/L Tris，pH7.5，0.15 mol/L NaCl，3.3 g/L Tween 20)于37℃洗滌4次，每次5 min;加入檢測平衡液(0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L MgCl2)，37℃，10 min。以上步驟均在搖床上勻速搖動進行。最后，加入BCIP/NBT顯色液250 μL，于室溫、黑暗且靜止條件下顯色反應。根據雜交信號結果，對SNP位點進行基因分型。

1.5 統計學處理 基因型數據采用SHEsis在線分析軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，單位點及等位基因的遺傳關聯分析。采用χ2檢驗比較病例組與對照組各SNP的基因型和等位基因頻率的差異，檢驗水準α=0.05/位點數。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 對照組rs2299225、rs11146020、rs2814351 和 rs778293 位點均符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡 (χ2=2.802、2.579、0.684 和1.095，P 均 ＞0.05)。

2.2 2組4個位點基因型及等位基因頻率比較見表2～5。

表2 2組rs2299225基因型及等位基因頻率比較 例(%)

表3 2組rs11146020基因型及等位基因頻率比較 例(%)

表4 2組rs2814351基因型及等位基因頻率比較 例(%)

表5 2組rs778293基因型及等位基因頻率比較 例(%)

3 討論

Chen等[8]的研究發現中國精神分裂癥患者與對照之間rs2299225等位基因頻率存在差異。Albalushi等[9]對日本人群的研究發現rs2299225位點與精神分裂癥有關聯。該研究顯示rs229925位點與精神分裂癥有關，是否與樣品類型有關有待進一步研究。Zhao等[10]在中國漢族群體中發現rs11146020(1001G/C)的C等位基因在患者組中高頻表達。Martucci等[11]在加拿大多倫多人群研究中未發現GRIN1基因與精神分裂癥有顯著關聯。該研究結果與Martucci等的研究結果一致。Guo等[12]在中國北方漢族人群中對GRID1的研究中發現位點rs2814351與精神分裂癥有關聯，而該研究未發現有關聯。同一多態性位點出現了不同的研究結果，可能與樣本的異質性或樣本數量有關。

關于G72/G30的基因研究有許多報道，普遍認為該基因與精神分裂癥顯著相關[13]，韓燕等[14]的研究結果是DAOA基因區域rs778294的一個等位基因(C)與精神分裂癥相關，而位點rs778293與精神分裂癥無關。該研究結果顯示rs778293位點與精神分裂癥有關，與韓燕等的研究不一致，但也支持G72/G30基因可能與精神分裂癥具有關聯性的觀點。G72/G30是人類特異性基因。已有研究[15]顯示G72基因表達在精神分裂癥患者腦前葉有所升高。以上研究表明，進一步研究G72/G30的SNP位點對精神分裂癥的研究具有重要意義。

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