中國(guó)北方地區(qū)漢族人群血小板膜糖蛋白ⅠbαVNTR多態(tài)性的分布與腦梗死患者CC基因型與阿司匹林敏感相關(guān)性分析

辛?xí)悦簦Y麗鑫，王 瑤，金英玉，張?jiān)破?/p>

（1．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，哈爾濱150001；2．北京朝陽(yáng)醫(yī)院京西院區(qū) 檢驗(yàn)科）

糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰb－Ⅸ－Ⅴ在血小板粘附于損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中起重要作用并參與剪切力介導(dǎo)的血小板活化。因此，編碼GPⅠb基因的多態(tài)性可能改變心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因素。13個(gè)氨基酸序列（絲氨酸399到蘇氨酸411）的可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)目（variable number of tandem repeats，VNTR）導(dǎo)致 GPⅠbα基因呈多態(tài)性并表現(xiàn)為A、B、C、D四種等位基因形式。不同民族GPⅠbαVNTR多態(tài)基因分布明顯不同。

阿司匹林是最常見(jiàn)抗血小板聚集藥，被廣泛運(yùn)用于心腦血管疾病的二級(jí)預(yù)防。然而，數(shù)據(jù)顯示阿司匹林抗血小板作用存在個(gè)體差異［1］，可能原因是一些病人存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）。重要血小板膜糖蛋白等位基因的多態(tài)性可導(dǎo)致重要黏附受體成分表達(dá)量的變化。現(xiàn)已證實(shí)，阿司匹林抵抗與血小板P1A1（GPⅢa）［2，3］和 GPⅠbα VNTR多態(tài)性BC基因型［4］有關(guān)。

本研究探討中國(guó)北方地區(qū)漢族人群GPⅠbα VNTR多態(tài)性分布情況并分析VNTR多態(tài)性的存在是否對(duì)低劑量阿司匹林（100mg／d）產(chǎn)生抵抗作用。

1 材料與方法

1．1 對(duì)象 選取300例中國(guó)北方地區(qū)健康的漢族人群；110例腦梗死患者，入院后服用阿司匹林（100 mg／d）至少7d以上，參考 Gum 等［5］的標(biāo)準(zhǔn)排除其它疾病。本項(xiàng)研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有受試對(duì)象均簽署遺傳分析知情同意書(shū)。阿司匹林抗血小板作用通過(guò)光學(xué)血小板聚集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。參考Gum等［5］提出的阿司匹林抵抗（AR）定義：以10μmol／L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）為誘導(dǎo)劑時(shí)血小板平均聚集率≥70%，以0．5g／L （arachidonic acid，AA）為誘導(dǎo)劑時(shí)血小板平均聚集率≥20%。阿司匹林半抵抗（Aspirin semi－responders，ASR）定 義 為 只 符 合 上 述 條 件 之一［5］。

1．2 VNTR多態(tài)基因型 從人類外周血單個(gè)核細(xì)胞分離出遺傳DNA，遺傳DNA 0．4ng加入20μl PCR反應(yīng)體系，該體系包括1．6μl dNTP，0．4μl上游引物（5’－CACTAC TGAACCAACCCCAAG－3’）和0．4μl下游引物（5’－TTGTGGCAGACACCAGGATGG－3’），2．0μl 10×PCR 緩 沖 液，0．1μl（5U）Taq DNA 聚合酶（TaKaRa，大連，日本）。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；38個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95℃變性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（三硼酸鹽／EDTA緩沖液），EB染色，確定基因型。100bp DNA作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。

2 結(jié)果

2．1 健康人群VNTR多態(tài)性分布

VNTR基因頻率見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增的DNA片斷為195，234，273bp，分別對(duì)應(yīng) D、C、B等位基因，等位基因A未檢測(cè)到。等位基因C頻率最高，其次是等位基因D。

2．2 患者的流行病學(xué)特征

如表2所示，ASR患者中女性、高血壓和高血脂者占的比率較AS者高，其他危險(xiǎn)因素在ASR和AS患者中無(wú)顯著差異。本研究沒(méi)發(fā)現(xiàn)阿司匹林完全抵抗的患者，ASR患者為9．1%。ASR患者用AA或ADP作為誘導(dǎo)劑的血小板聚集率明顯高于AS患者（P＜0．001）。

2．3 ASR和AS患者VNTR多態(tài)性的基因頻率

表3可見(jiàn)6種基因型：BB、BC、BD、CC、CD、DD。在AS組中，CC基因型表達(dá)最多，其次是CD、DD基因型。與AS組相比，ASR組BC和BD基因型分布增多。

表1 中國(guó)東北地區(qū)健康人群VNTR基因型與GPⅠbα等位基因

表2 患者的流行病學(xué)特征

表3 ASR和AS患者VNTR基因型頻率

3 討論

GPⅠbα是血小板膜表面主要的唾液酸蛋白，在初級(jí)止血中起重要作用。VNTR多態(tài)性研究始于日本人，他們使用十二基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。Ishida等研究證實(shí)了Moroi的發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了亞洲東部地區(qū)普遍存在的最多的單體基因型；而Simsek等研究發(fā)現(xiàn)在美國(guó)白種人中不存在A基因型；Marchese等對(duì)意大利白種人研究發(fā)現(xiàn)GPⅠbα只存在 、C、D三種基因型，同時(shí)對(duì)卡斯蒂利亞和吉普賽人的研究中也檢測(cè)出這三種基因型。1999年，Aramaki等的研究表明，之前報(bào)道的僅存在于亞洲東部人群的VNTR A基因型在北美印度安人也存在。這些研究與最初的本土美洲人是從東亞移民到北美的假設(shè)相一致。

不同民族GPⅠbαVNTR多態(tài)基因型分布明顯不同。盡管一些學(xué)者報(bào)道A基因型存在于中國(guó)人群，但本研究?jī)H檢測(cè)出中國(guó)東北地區(qū)人群B、C、D三種基因型。我們的研究與中國(guó)山東一位學(xué)者提出的相一致，可能是東北地區(qū)的人群很多是從山東省移民而來(lái)所致。

GPⅠbαVNTR多態(tài)CC基因型在既往患有腦梗死，同時(shí)對(duì)阿司匹林敏感的患者中過(guò)量表達(dá)。本研究不包括使用抗血小板藥物治療有效的心血管疾病患者。盡管VNTR多態(tài)CC基因型與阿司匹林敏感顯著相關(guān)，但由于標(biāo)本量較少，仍需進(jìn)一步大規(guī)模研究。

GPⅠb－Ⅸ－Ⅴ復(fù)合物是血小板表面主要的血管性血友病因子（vWF）受體。vWF與循環(huán)血液中血小板相互作用是誘發(fā)受損血管形成血栓的始動(dòng)環(huán)節(jié)。GPⅠbα呈高度多態(tài)，其中一種多態(tài)性是編碼巨糖肽的VNTR，這種類似粘蛋白的片斷分隔配體結(jié)合區(qū)域從血小板膜表面，此區(qū)域包含39個(gè)堿基序列串聯(lián)重復(fù)1到4次，對(duì)應(yīng)的基因型為D、C、B、A。隨著重復(fù)序列的增加，增加了巨糖肽的長(zhǎng)度即增加了配體結(jié)合區(qū)域和血小板膜表面的距離，從而更易接近配體結(jié)合區(qū)，對(duì)剪切力也更為敏感。活性和親和力的改變決定了整合素的功能。VNTR多態(tài)C基因型比A、B基因型短，可以推斷長(zhǎng)度的不同可以改變對(duì)VWF的親和力 ，從而影響血小板功能，盡管沒(méi)有足夠的證據(jù)加以證實(shí)［6］。

CC基因型患者對(duì)阿司匹林更為敏感，與GPⅠbα和VWF介導(dǎo)的剪切力引起的血小板活化相關(guān)。

體外阿司匹林抵抗有重要的臨床意義。當(dāng)前研究表明阿司匹林抵抗的存在使患主要心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)增加了3倍以上［7］。檢測(cè)阿司匹林抵抗有助于患有冠狀動(dòng)脈疾病和腦血管疾病的患者預(yù)測(cè)和降低主要心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)患者檢測(cè)出阿司匹林抵抗時(shí)，其他抗血小板治療尤為重要。阿司匹林抵抗是一直存在抑或隨時(shí)間發(fā)生改變?nèi)圆磺宄虼撕茈y決定其他治療的持續(xù)性［3］。

綜上所述，通過(guò)本研究對(duì)腦血管患者提供個(gè)體化治療具有一定的臨床意義。更為重要的是抗vWF治療的療效受GPⅠbα多態(tài)性影響，因此在臨床藥物研發(fā)過(guò)程中有必要考慮到這一點(diǎn)。

［1］Patrono C，Coller B，Dalen JE，et al．Platelet－active drugs：the relationships among dose，effective，and side effect［J］．Chest，2001，119，39S．

［2］Macchi L，Christiaens L，Brabant S，et al．Resistance in vitro to low－dose aspirin is associated with platelet P1A1（GPIIIa）polymorphism but not with C807T（GPIa／IIa）and C－5Tkozak（GPI－ba）polymorphisms［J］．Journal of the American College of Cardiology，42（6）：1115．

［3］Pamukcu B，Oflaz H，Nisanci Y．The role of platelet glycoprotein IIIa polymorphism in the high prevalence of in vitro aspirin resistance in patients with intracoronary stent restenosis［J］．American Heart Journal，2005，149（4）：675．

［4］Gervera A，Tassies S，Obach V，et al．The BC genotype of the VNTR polymorphism of platelet glycoprotein Iba is overrepresented in patients with recurrent stroke regardless of aspirin therapy［J］．Cerebrovascular Disease，2007，24（2－3）：242．

［5］Gum PA，Kottke－Marchant K，Poggio ED，et al．Profile and prevalence of aspirin resistance in patients with cardiovascular disease［J］．American Journal of Cardiology，2001，88（3）：230．

［6］Jilma－Stohlawetz P，Homoncik M，Jilma B，et al．Glycoprotein Ib polymorphisms influence platelet plug formation under high shear rates［J］．British Journal Haematology，2003，120（4）：652．

［7］Gum PA，Kottke－Marchant K，Welsh PA，et al．A prospective，blinded determination of the natural history of aspirin resistance among stable patients with cardiovascular disease［J］．Journal of the American College of Cardiology，2003，41（6）：961．