丙戊酸鈉逆轉組蛋白低乙酰化水平對肝癌細胞侵襲轉移的體外實驗研究

高峰 楊季紅 張愛民 馬芳 康然

丙戊酸鈉(sodium valproate，VPA)是目前臨床應用廣泛的抗癲癇藥物，近期研究發現其具有很強的組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histonedeacetylase inhibitor，HDACI)活性［1］，其通過逆轉組蛋白低乙酰化水平，上調相關抑癌基因表達，起到抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡或者誘導分化，同時還具有抑制腫瘤血管新生、抑制瘤細胞轉移的作用［2］，在白血病及多種實體瘤中顯現出較好的抗腫瘤效應，但其具體作用機制尚未明了。本研究通過觀察VPA對體外培養的人肝癌細胞系SMMC-7721細胞凋亡及細胞周期的影響，并觀察VPA對該細胞系體外侵襲、遷移和黏附能力的影響以及對乙酰肝素酶(heparanase，HPA)和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達的影響，進一步探討VPA的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌細胞系SMMC-7721細胞，由中國科學院上海細胞生物所提供。VPA(Sigma公司);RPMI-1640培養基及Trizol試劑(Gibco公司);胎牛血清(FCS)(杭州四季青公司);Annexin-V-FITC凋亡分析試劑盒(Becton Dickinson公司);Matrigel膠、Transwell小室(BD公司);Cytobuster TM細胞裂解液(Novagen公司);山羊抗人 HPA、PCNA、β-actin(Santa Cruz Biotechnology公司);辣根酶標記的兔抗山羊二抗及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及實驗分組:肝癌細胞株SMMC-7721細胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液，置于37℃、5%CO2(體積分數)、飽和濕度的培養箱內培養，待細胞貼壁生長達亞融合狀態時，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞備用。實驗用細胞均處于對數生長期，苔盼藍計數活細胞大于95%。設VPA濃度梯度為2、4、8 mmol/L為試驗組(n=3)，以等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)為對照組(n=3)，培養24、48或72 h。

1.2.2 流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率和細胞周期:不同濃度VPA作用細胞48 h，收集細胞，預冷PBS洗滌兩遍，1×Annexin-V緩沖液懸浮細胞，調整細胞濃度為1×106/ml，取懸液 100 μl，加入 Annexin-V-FITC 5 μl、碘化丙啶(PI)10 μl，避光染色15 min，每管加入300 μl的1×Annexin-V緩沖液，FCM檢測凋亡細胞陽性率和細胞周期變化，并以FCM檢測結果作為后繼試驗選擇藥物濃度和作用時間的參考依據。Annexin-V(-)并PI(-)為活細胞，Annexin-V(-)并PI(+)為機械損傷細胞，Annexin-V(+)并PI(+)為晚期凋亡細胞，試驗中以Annexin-V(+)作為凋亡細胞。

1.2.3 肝癌細胞體外遷移實驗:SMMC-7721細胞以2×105/孔接種于6孔板，培養至單層細胞覆蓋率90%左右，更換為無血清的RPMI1640培養基，饑餓培養12 h。用橡皮刮片在孔板中央刮出一條整齊的寬度為10 mm無細胞劃痕區，輕輕洗滌后棄上清，加入含10%胎牛血清培養液2 ml，并在孔內分別加入空白對照 PBS液和2、4、8 mmol/L的VPA。37℃、5%CO2下培養24 h。顯微鏡下放大100倍觀察刮痕區，每孔隨機選擇5個視野，計數每個視野中向刮痕中遷移的細胞總數。

細胞遷移抑制率(%)=(對照組遷移細胞數-試驗組遷移細胞數)/對照組遷移細胞數×100%。

1.2.4 肝癌細胞體外侵襲實驗:Transwell小室的聚碳酯膜下表面使用0.1%的明膠室溫包被過夜，上表面加入20 μl Matrigel，37℃、5%CO2下溫育1 h使膠凝固，用來模擬體內的細胞外基質和基底膜環境。SMMC-7721細胞制成2×105/ml細胞懸液，取 200 μl接種于 Transwell小室上室，分別加入 2、4、8 mmol/L的VPA，同時設對照組。下室中加入含10%FBS的NIH-3T3細胞培養上清液，37℃、5%CO2條件下培養24 h。去除濾膜上層細胞，4%多聚甲醛固定后行瑞氏吉姆薩染色。鏡下(×200)隨機選取5個視野，計數濾膜下表面的細胞數。實驗重復3次。以穿膜細胞相對數目表示SMMC-7721細胞的侵襲能力并計算侵襲抑制率。

細胞侵襲抑制率(%)=(對照組穿膜細胞數-試驗組穿膜細胞數)/對照組穿膜細胞數×100%。

1.2.5 肝癌細胞體外黏附能力試驗:不同濃度(2、4、8 mmol/L)的VPA作用SMMC-7721細胞24 h，以含10%血清的培養液重懸細胞，按2×105/孔接種于預先鋪好Matrigel的96孔板，設4個平行孔，繼續孵育60 min后每孔加入無血清的RPMI1640 培養基200 μl和 MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續孵育4 h。棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，震蕩 10 min，在全自動酶標儀492 nm波長處測定吸光度(OD)值。

細胞黏附率(%)=試驗組OD值/對照組OD值×100%。1.2.6 Western-blot法測定SMMC-7721細胞HPA及PCNA蛋白含量:收獲細胞后，冰PBS漂洗2次，收集細胞，立即加入500 μl細胞裂解液，冰上靜置 10 min，4℃、14 000 r/min離心10 min，取上清，考馬斯亮藍測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，加入1∶300稀釋的山羊抗人HPA多克隆抗體或山羊抗人PCNA多克隆抗體或1∶300稀釋的山羊抗人β-actin作為陽性對照，4℃過夜，用含0.1%Tween20的TBS洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗山羊二抗，37℃中作用1 h，洗膜后DAB顯色。將結果掃描成像后用GeL-ProAnalysis圖像分析軟件進行條帶吸光度值分析，以HPA(50 kU)、PCNA(36 kU)與β-actin(42 kU)測定結果的比值，作為 HPA和PCNA蛋白表達水平的參數，對HPA和PCNA產物相對定量。

1.3 統計學分析應用SPSS 12.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞凋亡率和細胞周期變化 經2、4、8 mmol/L VPA作用細胞48 h后FCM顯示，隨著VPA濃度增加，SMMC-7721細胞凋亡率逐漸增高。以8 mmol/L VPA分別作用細胞24、48及72 h后，檢測細胞凋亡率亦逐漸增高，各組差異有統計學意義(P＜0.05)，且呈現濃度和時間依賴性。細胞周期分析顯示G0/G1期、S期細胞百分率逐漸下降，而G2/M期細胞百分率逐漸升高，且呈濃度和時間依賴性(P＜0.05)。表1、2。

表1 不同濃度VPA作用48 h后SMMC-7721細胞凋亡率及細胞周期改變n=3，%，±s

表1 不同濃度VPA作用48 h后SMMC-7721細胞凋亡率及細胞周期改變n=3，%，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與2 mmol/L組比較，#P＜0.05;與4 mmol/L組比較，△P＜0.05

組別 凋亡率 G0/G1期 S期 G2/M期3.7±0.3 58.5±1.7 30.3±0.9 9.02±0.29 2 mmol/L組 9.7±0.4* 52.3±1.0* 25.2±0.9* 13.68±0.36*4 mmol/L組 19.8±1.1*# 47.4±1.4*# 19.3±0.7*# 18.69±0.80*#8 mmol/L組 35.6±1.7*#△ 39.6±1.2*#△ 11.0±1.1*#△ 23.98±1.32*#△對照組

表2 8 mmol/L VPA作用不同時間后SMMC-7721細胞凋亡率及細胞周期改變n=3，%，±s

表2 8 mmol/L VPA作用不同時間后SMMC-7721細胞凋亡率及細胞周期改變n=3，%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與24 h組比較，#P ＜0.05;與48 h組比較，△P ＜0.05

組別 凋亡率 G0/G1期 S期 G2/M期1.6±0.3 57.2±1.0 31.3±0.7 8.96±0.21 24 h 28.7±0.7* 48.4±1.0* 20.4±0.8* 19.38±0.82*48 h 35.6±1.7*# 39.6±1.2*# 11.0±1.1*# 23.98±1.32*#72 h 46.1±1.3*#△ 43.3±1.0*#△ 9.1±0.9*#△ 26.31±1.02*#△對照組(24 h)

2.2 肝癌細胞體外遷移實驗 不同濃度的VPA作用細胞24 h后，對照組向劃痕部位遷移細胞數目多于VPA試驗組，細胞遷移數目隨藥物濃度升高而逐漸減少，該作用呈濃度依賴性，組間差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

2.3 肝癌細胞體外侵襲實驗 不同濃度的VPA試驗組穿膜細胞數較對照組明顯減少，且呈現出濃度依賴性，計算得出細胞侵襲抑制率亦隨實驗濃度升高而逐漸升高，組間差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表3。

2.4 肝癌細胞體外黏附能力試驗 VPA試驗組吸光度(OD)值明顯低于對照組，隨VPA濃度由2、4、8 mmol/L遞增，計算得出各濃度組細胞黏附率呈降低趨勢，組間差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表3。

2.5 SMMC-7721細胞HPA及PCNA蛋白含量的變化 Western-blot結果顯示，對照組HPA和PCNA蛋白表達水平較高，隨著VPA濃度的升高，HPA和PCNA蛋白表達水平逐漸下降，組間差異有統計學意義，存在濃度依賴性(P＜0.05)。同一濃度下隨作用時間延長，該下調作用亦逐漸加強，組間差異有統計學意義，即存在時間依賴性(P＞0.05)。見表4。

表3 不同濃度VPA對SMMC-7721細胞遷移、侵襲、黏附能力的影響n=3，%，±s

表3 不同濃度VPA對SMMC-7721細胞遷移、侵襲、黏附能力的影響n=3，%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與2 mmol/L組比較，#P ＜0.05;與4 mmol/L組比較，△P ＜0.05

組別 細胞遷移抑制率 細胞侵襲抑制率 細胞黏附率對照組000 2 mmol/L組 31.36±0.07* 45.68±0.05* 68.95±4.36*4 mmol/L組 58.21±0.08# 65.65±0.03# 42.63±4.62#8 mmol/L組 69.89±0.08#△ 76.92±0.06#△ 18.59±3.69#△

表4 不同濃度VPA作用不同時間SMMC-7721細胞HPA和PCNA蛋白含量測定n=3，±s

表4 不同濃度VPA作用不同時間SMMC-7721細胞HPA和PCNA蛋白含量測定n=3，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與A組比較，#P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05;與同一濃度組24 h比較，☆P＜0.05;與同一濃度組48 h比較，▲P＜0.05

作用時間 對照組 VPA 試驗組A組(2 mmol/L) B組(4 mmol/L) C組(8 mmol/L)HPA 24 h 2.205±0.086 1.908±0.156* 1.555±0.070*# 0.881±0.047*#△△☆▲48 h 2.339±0.092 1.695±0.162＊☆ 1.327±0.118*#☆ 0.639±0.081*#△☆72 h 2.345±0.091 1.593±0.107＊☆▲ 1.025±0.149*#☆▲ 0.597±0.008*#△☆▲PCNA 24 h 2.325±0.100 2.162±0.163* 1.773±0.097*# 1.141±0.061*#△48 h 2.354±0.205 1.829±0.071＊☆ 1.565±0.061*#☆ 0.897±0.120*#△☆72 h 2.361±0.168 1.699±0.109＊☆▲ 1.251±0.073*#☆▲ 0.561±0.101*#

3 討論

肝細胞性肝癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤死亡分類構成中高居第二位［3］。目前認為，腫瘤的發生最終由基因組水平的改變引起，是一個多基因事件累積的復雜過程。其中，組蛋白的乙酰化調節是基因表達調控的關鍵環節之一，其由一對功能相互拮抗的蛋白酶，即組蛋白乙酰化酶(histoneacetylase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)共同調控，二者之間的動態平衡控制著染色質結構和基因的正常有序表達。已有研究報道，HDAC水平與多種腫瘤的發生發展相關［4］，而HDACI可通過促進組蛋白乙酰化水平，上調相關抑癌基因表達，起到抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡或者誘導分化的作用［1］，但其作用機制尚未闡明。VPA是臨床常用的抗癲癇藥，最近研究發現它有較強的HDACI活性［2］。研究證明HDACI可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉移、降低腫瘤侵襲力等機制發揮抗腫瘤作用［5］。

本研究觀察了VPA對SMMC-7721細胞凋亡及細胞周期的影響，流式細胞儀檢測結果提示隨著VPA濃度增加和作用時間的延長，SMMC-7721細胞凋亡率逐漸增高，表明 VPA對SMMC-7721細胞具有誘導凋亡作用，且呈現濃度和時間依賴性。細胞周期分析顯示隨著VPA濃度增加，G0/G1期、S期細胞百分率逐漸下降，分別由(58.53±1.68)%、(30.32±0.87)%降至(39.64±1.22)%、(11.02±1.09)%。而G2/M期細胞百分率逐漸升高，由(9.02±0.29)%增至(23.98±1.32)%，提示VPA能使細胞周期阻滯于G2/M期，顯著抑制了腫瘤細胞的增殖，這與Kaiser等［6］的研究結果一致。PCNA作為DNA聚合酶δ的輔助蛋白直接參與DNA的合成，其表達與細胞周期相關，是評價細胞增殖狀態的生物學活性指標［7］。有研究表明，PCNA異常表達于多種腫瘤細胞，其高表達與腫瘤的惡性程度和預后密切相關［8］。本實驗同時觀察到不同濃度的VPA作用于肝癌SMMC-7721細胞不同時間后，細胞中PCNA蛋白的表達顯著下調，并呈現時間依賴性和濃度依賴性。提示VPA可能通過下調PCNA的表達，抑制腫瘤細胞的增殖化。

細胞體外遷移實驗、侵襲試驗以及黏附能力試驗均為體外模擬并檢測腫瘤細胞惡性生物學特性的經典試驗方法。腫瘤細胞的黏附是惡性腫瘤發生侵襲轉移的始發步驟，黏附作用包括同質黏附(細胞—細胞黏附)和異質黏附(細胞—基質黏附)，同質黏附能力下降，有利于瘤細胞脫離原發腫瘤而向遠處轉移，異質黏附能力增強則有利于轉移的瘤細胞和轉移處的基質結合，繼而釋放蛋白酶降解基質，便于瘤細胞在轉移部位侵襲性生長。參與腫瘤侵襲轉移的分子成員眾多，HPA是目前發現的哺乳動物細胞中唯一能切割細胞外基質中HSPG側鏈的內源性糖苷酶，通過破壞基底膜的完整性，促進腫瘤浸潤、轉移，同時還可促進VEGF、bFGF等腫瘤血管生成相關因子的表達以及促進腫瘤細胞的增殖，其在腫瘤中的高表達提示預后不良［9，10］。而應用反義寡核苷酸或RNA干擾技術降低肝癌細胞HPA的表達，可顯著抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移能力［11］。本試驗將不同濃度VPA作用SMMC-7721細胞不同時間，觀察瘤細胞生物學特性的變化，結果表明，試驗組細胞遷移能力、侵襲能力以及細胞黏附能力均顯著低于對照組，提示VPA能顯著抑制腫瘤細胞侵襲轉移能力。試驗進一步檢測了VPA對SMMC-7721細胞 HPA表達的影響，Western-blot結果顯示，對照組HPA蛋白表達水平較高，而試驗組隨著VPA濃度的升高和作用時間的延長，HPA蛋白表達水平第次下降，存在濃度依賴性和時間依賴性。提示VPA可通過降低SMMC-7721細胞HPA的表達，弱化瘤細胞降解突破基底膜以及與轉移處基質的黏附能力，間接發揮其抑制瘤細胞侵襲轉移的抗腫瘤效應。

綜上所述，本試驗應用VPA逆轉肝癌細胞系SMMC-7721細胞組蛋白低乙酰化修飾水平，可顯著抑制癌細胞增殖，降低癌細胞侵襲轉移能力。下調HPA和PCNA表達可能是其發揮作用的主要機制之一。VPA作為新近證實的HDACI在肝癌的治療方面存在較好的應用前景。

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