氯沙坦對心力衰竭大鼠心肌細胞縫隙連接的作用機制研究

孫琪 戚國慶 石宇杰 張健 張艷苓

心力衰竭(心衰)是各種心臟病并發癥之一，為老年人常見病，并常伴有各種心律失常。心衰時腎-血管緊張素系統(RAS)被激活，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平升高，加劇了水鈉潴留和周圍血管阻力，進一步導致心室擴張，最后引發心衰，因此阻斷RAS系統，已成為心衰治療的方向之一［1］。心室中心肌細胞連接通道主要由縫隙連接蛋白43(Cx43)構成，研究表明心衰發生時Cx43大量被降解并且會分布紊亂，導致Cx43蛋白重構，進而引起心律失常［2］。縫隙連接蛋白45(Cx45)主要表達在心房中，它能夠調控Cx43通道發揮其在心衰中的作用［3］。氯沙坦為AngⅡ受體(AT1)抑制劑，本實驗將觀察氯沙坦對心衰大鼠心功能的影響，并進一步探討其對心衰大鼠心肌細胞間連接的作用，為臨床心衰的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXK(京)2006-0009。隨機分為假手術組、模型組及氯沙坦(默沙東制藥有限公司)高、中、低組(16 mg/kg、8 mg/kg、4 mg/kg)，每組12只。

1.2 造模方法 大鼠均采用灌胃給藥，氯沙坦高、中、低組分別給予16 mg/kg、8 mg/kg、4 mg/kg的氯沙坦，連續 7 d。假手術組和模型組均給予等體積的蒸餾水，末次給藥30 min后，復制心衰大鼠模型:大鼠烏拉坦麻醉，剪開左鎖骨中線縱行切開皮膚約2 cm，在第3、4肋間鈍性分離，打開胸腔，剪開心包，輕壓右側胸腔，擠出心臟，在肺動脈圓錐左緣、左心耳下緣1 mm處經淺層心肌以0-0線結扎左冠脈前降支，迅速將心臟放回胸腔，縫合。以檢測的心功能指標異常為造模成功的標志。假手術組不結扎。

1.3 檢測指標

1.3.1 檢測心功能:大鼠造模后4 h，連接生理記錄儀(成都泰盟BL-420F)，經大鼠右側頸總動脈插管，測定收縮壓、舒張壓、心率，將管進入左心室，測定左心室壓峰值(LVP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室內壓最大上升速率(+LVdp/dtmax)、左心室內壓最大下降速率(-LVdp/dtmax)。

1.3.2 Cx43和Cx45蛋白的表達:Cx43和 Cx45蛋白采用Western Blot化學發光法檢測。RIPA裂解法從大鼠心肌提取總蛋白，將蛋白樣品進行12%的SDS-PAGE凝膠電泳，4℃恒壓電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，后加入一抗(1∶200稀釋的 Cx43、Cx45，1∶1 000 稀釋的 GAPDH 內參)，4℃ 孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋濃度1∶1 000)，ECL暗室發光顯色，凝膠成像系統照相掃描灰度值分析，以目的蛋白灰度值與GAPDH的灰度值比值用于統計分析。

1.4 統計學分析應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以±s表示，多組間兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠存活 模型組、氯沙坦低、中、高組分別有3、2、1、1只大鼠死亡。余皆造模成功。

2.2 心功能變化 與假手術組比較，模型組大鼠心功能明顯異常，LVP、+LVdp/dtmax明顯下降，LVEDP明顯上升(P＜0.01);與模型組比較，氯沙坦組可顯著改善心衰大鼠心功能，低、中、高劑組 LVP明顯上升(P ＜0.01)，LVEDP明顯下降(P＜0.05或＜0.01)，且高劑組+LVdp/dtmax也明顯上升(P＜0.01)。與低劑量組比較，高劑量組 LVP、LVEDP、+LVdp/dtmax差異有統計學意義(P＜0.01);與中劑量組比較，高劑量組LVEDP、+LVdp/dtmax差異有統計學意義(P＜0.05或＜0.01)。5組-LVdp/dtmax變化差異無統計學意義(P＞0.05)。5組血壓、心率差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 氯沙坦對心衰大鼠心功能的影響±s

表1 氯沙坦對心衰大鼠心功能的影響±s

注:1 mm Hg=0.133 kPa;與假手術組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與氯沙坦低劑組比較，☆P＜0.01;與氯沙坦中劑組比較，▲P＜0.05，★P＜0.01

組別 LVP(mm Hg)LVEDP(mm Hg)+LVdp/dtmax(mm Hg/ms)-LVdp/dtmax(mm Hg/ms)105±12 5.1±1.0 4.2±0.5 -2.39±0.34模型組(n=9) 78±8* 8.6±1.3* 2.3±0.4* -2.47±0.29氯沙坦低劑組(n=10) 85±9△ 7.7±1.1# 2.4±0.3 -2.68±0.31氯沙坦中劑組(n=11) 93±9△ 7.2±1.4△ 2.4±0.4 -2.55±0.33氯沙坦高劑組(n=11) 100±10△☆ 6.0±1.0△☆▲ 3.6±0.4△☆★假手術組(n=12)-2.51±0.28

2.3 縫隙連接蛋白43、45表達 與假手術組比較，模型組Cx43蛋白表達明顯降低(P＜0.01)，Cx45蛋白表達明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，氯沙坦能顯著提高Cx43表達，降低Cx45表達，其中，中、高劑量組差異有統計學意義(P＜0.05或＜0.01)。與低劑量組比較，中、高劑量組Cx43、Cx45差異均有統計學意義(P＜0.01)，與中劑量組比較，高劑量組Cx45有統計學意義(P ＜0.01)。見表2，圖1。

表2 氯沙坦對心衰大鼠心肌組織Cx43、Cx45表達的影響n=3，±s

表2 氯沙坦對心衰大鼠心肌組織Cx43、Cx45表達的影響n=3，±s

注:與假手術組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與氯沙坦低劑組比較，☆P＜0.01;與氯沙坦中劑組比較，▲P＜0.01

Cx43 Cx45假手術組(n=12)組別0.75±0.15 0.23±0.05模型組(n=9) 0.15±0.03* 0.89±0.18*氯沙坦低劑組(n=10) 0.24±0.04 0.78±0.16氯沙坦中劑組(n=11) 0.48±0.06△☆ 0.55±0.08#☆氯沙坦高劑組(n=11) 0.52±0.07△☆ 0.42±0.05#☆▲

3 討論

RAS由腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉化酶、血管緊張素及其受體組成，研究發現，心衰普遍存在有RAS系統的激活，引起的血管緊張素及其受體升高，能夠增加心臟前后負荷，進一步發展為心室擴張，并且有文獻報道血管緊張素受體升高的幅度與心衰損傷程度呈正相關，因此抑制血管緊張素受體表達能夠保護心臟［4，5］。氯沙坦為血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑，它能特異性抑制血管AngⅡ和受體AT1R進行結合，進而抑制AngⅡ與AT1R結合所引起的外周血管收縮、交感神經興奮和壓力感受器敏感性增加等作用［6］。本結果表明氯沙坦能夠明顯升高LVP、+LVdp/dtmax，降低LVEDP，改善心功能，提示氯沙坦對心功能有明顯的改善作用。

Cx43在哺乳類動物心室肌細胞中發揮作用，其表達水平下降和分布紊亂表明心肌細胞間連接被破壞而且功能紊亂，導致了心肌組織傳導速度減慢，又因傳導的方向發生了改變，形成傳導阻滯和折返傳導，最后發生了心律失常，因此Cx43的表達下降和分布紊亂是心衰后在分子水平上發生的心肌細胞最初重構，也是心肌細胞心律失常的基礎［7，8］。本實驗觀察到心衰的大鼠，Cx43表達明顯下降，與文獻報道一致［9］。提示了Cx43在心衰大鼠中具有重要意義。Cx45主要存在于心房中，近來的研究發現Cx45可能在缺血性心臟病［10］、心衰中起著調控Cx43通道的作用。Betsuyaku等［11］報道了在人心衰發生時，Cx43表達水平降低，Cx45表達水平增加，本實驗也得到了相似的結果，即心衰大鼠心肌組織中Cx43表達降低，Cx45表達增加。

圖1 氯沙坦對心衰大鼠心肌組織Cx43、Cx45蛋白表達的影響(western-blot)

實驗結果表明，氯沙坦能夠顯著升高心衰后大鼠Cx43的表達，降低Cx45的表達，減輕心肌病理損傷，顯著改善心功能，尤以氯沙坦中高劑量組作用顯著。說明氯沙坦對心衰大鼠心功能的改善作用可能與增加Cx43的表達、降低Cx45的表達相關，同時，Cx43的表達增加也提示氯沙坦對心室的間隙連接通道有保護作用，可以提高心室傳導速度，從而降低心律失常的發生。

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