Kiss-1基因啟動子甲基化與結直腸癌的關系

陳志華，戴起寶，陳紹勤，林素勇

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，福建福州350005)

結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因參與的、多階段多步驟的演變過程，腫瘤轉移抑制基因Kiss-1與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切。隨著結直腸癌惡性演進，Kiss-1基因表達下降，但具體原因尚不明確，可能與DNA啟動子甲基化修飾參與調控抑癌基因的表達等因素有關。本研究通過檢測不同組織中Kiss-1基因啟動子甲基化狀態(tài)，分析其與結直腸癌臨床病理學特征的關系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2011年4月至2011年8月福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科腸鏡切取的142例正常結直腸組織、23例結直腸腺瘤、手術切除的73例新鮮結直腸癌瘤體及癌旁組織標本，液氮保存。入選的結直腸癌病例術前未經化療、放療;平均年齡59.28歲;男性39例，女性34例;淋巴結轉移30例;遠處轉移5例，其中肝臟轉移3例，肺部轉移2例。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒和蛋白酶K(北京白泰克公司)，亞硫酸氫鈉和對苯二酚(Sigma公司)，Wizard DNA Clean-Up System試劑盒(Promega公司)，CpG甲基化酶M.SssⅠ(New England Biolabs公司)。Kiss-1基因引物參照文獻［1］設計，由上海生物技術工程有限公司合成。見表1。

表1 Kiss-1基因甲基化特異PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1 甲基化特異性PCR 應用基因組DNA提取試劑盒提取結直腸組織基因組DNA，定量后取2 μg DNA按照甲基化特異性PCR修飾DNA，修飾后DNA用Wizard DNA Clean-Up System試劑盒純化，并回收DNA，溶于20 μL滅菌去離子水，-20℃保存?zhèn)溆谩７磻w系25 μL，修飾后 DNA 3 μL，10 × Taq Buffer 2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，25 mmol·L-1MgCl21.5 μL，引物各 1 μL，Taq 酶 0.2 μL;反應條件:95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 個循環(huán)，72℃ 7 min。取5 μL PCR產物加入2 μL上樣緩沖液，于質量分數2%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.3.2 對照組設置 在每批PCR擴增時均設置甲基化陽性對照(CpG甲基化酶M.SssⅠ修飾后新鮮胎盤組織DNA為模板)、甲基化陰性對照(胎盤組織DNA為模板)和陰性對照(H2O為模板)。

1.3.3 結果判斷 DNA樣品經甲基化特異性引物(M)和非特異性引物(U)擴增，DNA markerⅠ標記，是否為特異引物擴展特異產物。M有特異產物，而U無產物，判斷為純合型甲基化陽性;如果兩者都有特異產物，判斷為雜合型甲基化陽性;如果U擴展出特異產物，而M無產物，判斷為甲基化陰性;如果兩者均無特異產物，實驗失敗，重做。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，計數資料比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Kiss-1基因啟動子甲基化檢測結果 不同組織中Kiss-1基因啟動子甲基化檢測結果見圖1。

2.2 Kiss-1基因啟動子甲基化狀態(tài)的比較 結直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率為82.2%，癌旁組織為30.1%，結直腸腺瘤組織為21.7%，正常結直腸組織為6.3%，陽性率在結直腸癌、癌旁組織、結直腸腺瘤、正常結直腸組織中依次下降，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同組織中Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率的比較

2.3 Kiss-1基因啟動子甲基化狀態(tài)與結直腸癌臨床病理學特征的關系 Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率與結直腸癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及遠處轉移有關(P＜0.05)。見表3。

3 討論

Kiss-1基因是Lee等［2］在黑色素瘤細胞株中發(fā)現的腫瘤轉移抑制基因，Kiss-1基因表達產物可以抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的分化和凋亡。國內外研究［3-4］表明Kiss-1基因表達下降與惡性腫瘤的轉移特性和不良預后有關，本課題組前期研究［5-6］發(fā)現Kiss-1基因表達缺失可以促進結直腸癌的轉移，但Kiss-1基因表達水平改變的原因尚不明確。

表3 結直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化狀態(tài)與臨床病理學特征之間的關系

基因異常甲基化是導致抑癌基因失活的主要原因之一，腫瘤相關基因的啟動子發(fā)生了異常甲基化，如結直腸癌組織中 MLH1、APC、MGMT、RASSF1A、P16 等基因均發(fā)現異常甲基化現象，導致基因表達下降，從而抑制其在信號轉導、細胞周期調節(jié)、DNA修復、血管形成等方面發(fā)揮重要作用，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移［7-8］。有研究［9］發(fā)現膀胱癌組織中 Kiss-1基因啟動子異常甲基化，且與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，與Kiss-1基因表達下降密切相關，促進膀胱癌浸潤、轉移的發(fā)生。

本研究結果顯示:結直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率為82.2%，癌旁組織為30.1%，結直腸腺瘤組織為21.7%，正常結直腸組織為6.3%，在結直腸癌發(fā)生的不同階段，Kiss-1基因啟動子甲基化陽性率有明顯差異，提示Kiss-1基因啟動子甲基化可能促進結直腸癌的發(fā)生。隨著結直腸癌的分化程度降低、浸潤深度進展和轉移發(fā)生，Kiss-1基因啟動子甲基化程度逐步增高，Kiss-1基因啟動子異常甲基化有可能促進結直腸癌的惡性演進，Kiss-1基因啟動子甲基化水平的檢測對臨床評估結直腸癌轉移風險和預后可能有一定的參考價值。

DNA甲基化是一種可逆的過程，Yamashita等［1］應用5-脫氧雜氮胞苷逆轉胃癌細胞珠Kiss-1基因啟動子異常甲基化，發(fā)現Kiss-1基因的表達明顯升高，通過逆轉結直腸癌組織中Kiss-1基因啟動子甲基化狀態(tài)亦有可能提高Kiss-1基因的表達水平，進而降低結直腸癌轉移潛能，這為預防和治療結直腸癌轉移提供了新思路。

［1］Yamashita S，Tsujino Y，Moriguchi K，et al.Chemical genomic screening for methylation-silenced genes in gastric cancer cell lines using 5-aza-2’-deoxycytidine treatment and oligonucleotide microarray［J］.Cancer Sci，2006，97(1):64-71.

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［3］Guan-Zhen Y，Ying C，Can-Rong N，et al.Reduced protein expression of metastasis-related genes(nm23，KISS1，KAI1 and p53)in lymph node and liver metastases of gastric cancer［J］.Int J Exp Pathol，2007，88(3):175-183.

［4］Prentice LM，Klausen C，Kalloger S，et al.Kisspeptin and GPR54 immunoreactivity in a cohort of 518 patients defines favourable prognosis and clear cell subtype in ovarian carcinoma［J］.BMC Med，2007，5:33.

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［6］陳紹勤，林素勇，戴起寶，等.腫瘤轉移抑制基因Kiss-1對構建原代人結直腸癌裸鼠肝轉移瘤模型的影響［J］.中華實驗外科學，2012，29:209-211.

［7］Ahlquist T，Lind GE，Costa VL，et al.Gene methylation profiles of normal mucosa，and benign and malignant colorectal tumors identify early onset markers［J］.Mol Cancer，2008，7:94.

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［9］Cebrian V，Fierro M，Orenes-Pi?ero E，et al.KISS1 methylation and expression as tumor stratification biomarkers and clinical outcome prognosticators for bladder cancer patients［J］.Am J Pathol，2011，179(2):540-546.