富含γ－氨基丁酸清酒酒曲的研究

吳岱熹，吳 非

(東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

富含γ－氨基丁酸清酒酒曲的研究

吳岱熹，吳 非*

(東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030）

以篩選出的霉菌和大米為原料制作富含γ－氨基丁酸同時具有較高糖化酶活力的清酒酒曲。通過篩選確定了米曲霉3.800和尚志長香米為最佳組合，并對其酒曲產γ－氨基丁酸條件進行了優化。最終結果為將大米浸泡在含有7.5mg/mL VC和2.0mg/mL L－谷氨酸鈉水溶液中一夜后蒸熟，然后將30℃下培養6d的米曲霉3.800以40mg/100g蒸米的接種量接種到蒸米中制作酒曲，酒曲采用變溫培養，即在30℃培養20h，32℃培養4h，35℃培養14h，38℃培養8h，以此得到的酒曲中γ－氨基丁酸含量為6.936mg/g酒曲，清酒中含量為0.439mg/mL。

γ－氨基丁酸，酒曲，清酒，大米

日本清酒是低酒精度的大米釀造酒，因其氣味芳香，口感綿柔，營養豐富而受到人們的喜愛。清酒釀造工藝是由我國黃酒的釀造工藝演變而成的［1］，但又有許多不同的地方。清酒采用精白度高的精米為原料，將米曲霉接種到蒸熟并冷卻后的蒸米中制作酒曲。清酒最大特點是采用低溫下三次投入釀造方法，即將酒曲、蒸米以及水分三次投入發酵罐中。這樣可避免酸性蛋白酶的不足，使α－淀粉酶充分發揮作用，保證了酵母繁殖的一定密度，保證了發酵階段所需的酸度和酒精含量［2］。γ－氨基丁酸(簡稱GABA)是哺乳動物中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質，具有降低血壓、提高記憶力、緩解抑郁等生理功能。近年來對富含GABA食品的研究和開發日益增多，比如富含GABA的發芽糙米、茶、奶酪等［3］。有報道稱蒸米中接種以L－谷氨酸鈉作為底物生長的霉菌，培養后的酒曲中富集了大量的GABA［4］。提高酒曲中GABA含量對最終成品酒中GABA含量起到相當重要的作用。酒曲中菌種和大米的選擇會影響酒曲中GABA含量。實驗中從米曲霉接種到蒸米中時的種齡、米曲霉培養溫度、酒曲的接種量、酒曲培養溫度變化方式以及浸泡大米的水溶液中添加物質、物質濃度幾個方面對成酒曲中GABA含量的影響進行了研究。本文目的在于探討如何富集清酒中GABA，為發酵酒中功能性物質的富集提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

米曲霉3.800、黑曲霉3.4309、黑曲霉3.1858 黑龍江微生物研究所;米曲霉3.5232 中國科學院微生物研究所;黃酒活性干酵母 安琪公司;馬鈴薯培養基 用于培養米曲霉3.800;察氏培養基 用于黑曲霉3.4309、3.1858和米曲霉3.5232;γ－氨基丁酸(簡稱GABA) sigma試劑公司;其它所有試劑 均為分析純。

DHP－360型電熱恒溫培養箱、恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;SW－CJ－1D型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;PHS－25C型數字酸度計 上海大譜儀器有限公司;YXQ－LS－75S11型立式蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;LD－100小型粉碎機 長沙市常宏制藥機械制備廠;TGL－16C型高速離心機 上海安亭科學儀器廠;UV－6000PC型紫外－可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 清酒的制作工藝

1.2.2 釀酒操作要點 a.一投是將一定量的酒曲、酒母、蒸米、水和乳酸投入到發酵罐中;二投和三投是在一投后的第2d和第3d進行(二投和三投只是將酒曲、蒸米和水投入到發酵罐中);b.安琪黃酒活性干酵母作為酒母添加;c.清酒發酵采用10℃左右的低溫發酵。

1.2.3 酒曲中GABA含量測定方法 GABA含量測定:取成熟酒曲樣品于60℃烘至恒重，粉碎機粉碎成細粉，過 100 目篩子［5］，精確稱取 5.00g，放入 50mL 60%乙醇溶液中，于70℃水浴中浸提2h，然后以3000r/min離心5min，上清液為待分析樣品［6］。取上清液1mL，加入pH為10的0.1mol/L四硼酸鈉緩沖液，再加入顯色劑1mL苯酚(6%)和1mL次氯酸鈉(活性氯為7.5%)，沸水浴10min，立即冷水浴5min，最后加入2mL 60%乙醇溶液，在645nm下測吸光度值。

1.2.4 酒曲糖化酶活力測定方法 糖化酶活力測定:參照王福榮的釀酒分析與檢測中黃酒酒曲的糖化酶活力測定［7］。

1.2.5 制作富含GABA酒曲的菌種篩選 將米曲霉3.800、3.5232，黑曲霉3.4309、3.1858 分別接種到蒸熟并冷卻后的尚志長香米中制作清酒酒曲。酒曲采用變溫培養(30℃ 培養 20h，32℃ 培養 4h，35℃ 培養14h，38℃培養 8h)。待酒曲成熟后，測定酒曲中GABA含量。

1.2.6 制作富含GABA酒曲的大米篩選 將米曲霉3.800分別接種到四種優質東北大米中，即尚志長香米，扎龍長粒香米，五常稻花香和純響大米制作清酒酒曲，測定酒曲中GABA含量。

1.2.7 富含GABA清酒酒曲制作工藝的優化 采用單因素方法研究米曲霉3.800在馬鈴薯培養基中的培養時間(3、4、5、6、7d)，培養溫度(26、28、30、32、34℃);酒曲中霉菌的接種量(20、30、40、50、60mg/100g蒸米)，酒曲的培養溫度變化方式(變溫和恒溫培養)，浸泡米的水溶液中維生素C濃度(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mg/mL)和 L－谷氨酸鈉濃度(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mg/mL)［8］對 GABA 含量的影響。

1.2.8 清酒指標測定 用維生素C和L－谷氨酸鈉水溶液浸泡的米做酒曲，采用1.2.1清酒釀造方法，以浸泡水中無添加的米制成酒曲而釀造的清酒作為對比。測定發酵過程中以上兩個酒醪中GABA含量變化;發酵結束后，比較兩種酒GABA含量和酒精度、總酸、總糖理化指標，理化指標的測定參照王福榮的釀酒分析與檢測中黃酒成品分析［7］。

1.2.9 數據處理 原始數據整理采用Microsoft Excel(Office 2007)軟件完成，采用 Sigmaplot 9.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 制作富含GABA酒曲的菌種篩選結果

將培養成熟的四種霉菌分別接種到冷卻后的蒸米中，采用變溫培養方式制作酒曲，酒曲成熟后測定每種酒曲的GABA含量和糖化酶活力，結果如圖1所示。

圖1霉菌種類對酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.1 Effect of mold varieties on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

從圖1得出，米曲霉3.800所產GABA最多，黑曲霉3.1858和3.4309雖然產GABA也較多，但是糖化酶活力偏高。清酒酒曲中糖化酶活力范圍為125～305U/g，標準活力為 250U/g［9］。米曲霉 3.800 制成酒曲的糖化酶活力為252U/g，在標準范圍內。黑曲霉3.1858和3.4309糖化力明顯高于標準很多，這對于清酒酒質有很大影響。太高的糖化酶活力會導致酒醪中糖類物質和酒精積聚，高糖度和高酒精度均不利于酵母菌生長，酒醪中酒精含量太多會超出清酒酒精度的范圍。

2.2 制作富含GABA酒曲的大米篩選結果

實驗中選擇了黑龍江四種糧食著名產區的高級粳米作為清酒酒曲釀造的原料米。四種原料米和其制成的酒曲中GABA含量、糖化酶活力，結果如表1所示。

表1 大米種類對酒曲產GABA的影響Table 1 Effect of rice varieties on the production of GABA in the koji

清酒釀造中酒曲、酒母及發酵用米都必須是精白率較高的粳米，要求顆粒大、心白率高、蛋白質和脂肪含量少及淀粉含量高。原料米的品質對清酒的營養成分、口感、質地有著重要的影響。GABA的含量與稻米的品種有關［10］。因此大米種類對酒曲以及成品酒中GABA含量有影響。從表1可以看出，四種米制成的酒曲中GABA含量有顯著差別，尚志長香米酒曲中含量最高。通過對比表1中大米本身和其制作的酒曲中GABA含量發現不成正比關系，這可能由于各種米中谷氨酸含量差別產生的。生物體系中GABA的產生是L－谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下生成的，如果米中底物谷氨酸含量低，可能會導致霉菌在酒曲中產生低含量的GABA。

2.3 富含GABA清酒酒曲制作工藝的優化結果

2.3.1 米曲霉3.800在馬鈴薯培養基中培養溫度對酒曲產GABA的影響 將接種到馬鈴薯培養基(簡稱PDA培養基)中的米曲霉3.800分別在不同溫度下培養，成熟后接種到蒸米中制成酒曲，米曲霉3.800在PDA培養基中培養溫度對酒曲產GABA的影響如圖2所示。

圖2 米曲霉3.800在PDA培養基中培養溫度對酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.2 Effect of incubation temperature of Aspergillus oryzae 3.800 in PDA medium on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

微生物的生命活動是由一系列的生物化學反應組成的，而這些化學反應受到溫度影響又極其明顯，因此微生物的生長均有其特定的溫度范圍，在適宜溫度范圍內培養微生物能夠促進其生長和代謝活動［11］。酒曲中GABA含量既與霉菌的生物量有關又受谷氨酸脫羧酶酶活的影響。圖2顯示，在30℃時酒曲中GABA含量最多，這是酶活和生物量兩因素綜合的最佳結果，此時糖化酶活力雖然不高，但是在標準范圍內。

2.3.2 米曲霉3.800在馬鈴薯培養基中培養時間對酒曲產GABA的影響 將充分活化至活性完全恢復的米曲霉3.800傳代接種到PDA培養基中培養，在培養的第3、4、5、6、7d，分別將米曲霉3.800 接種到蒸米中制作酒曲。米曲霉3.800在PDA培養基中培養時間對酒曲產GABA的影響如圖3所示。

圖3 米曲霉3.800在PDA培養基中培養時間對酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.3 Effect of incubation time of Aspergillus oryzae 3.800 in PDA medium on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

從圖3中看出，米曲霉3.800在PDA培養基中生長時間(即3.800接種到蒸米時的種齡)對酒曲GABA含量有影響。接入蒸米時霉菌種齡小，導致酒曲中菌絲量少，影響酒曲質量;接入時霉菌種齡大，由于菌體活力不夠，會引起產酶能力的下降和菌體的過早衰老、自溶。因此，選擇合適的種齡既有利于菌體的快速增長又能使得菌體產酶量達到最大［12］。GABA屬于次級代謝產物，應該在霉菌生長對數期后期大量產生，在此時期接入蒸米中，霉菌的谷氨酸脫羧酶酶活應處于最高時期，利于酒曲中GABA富集。本實驗中米曲霉在PDA培養基中生長到第6d時接種，生成的GABA最多，為3.783mg/g，同時糖化酶活力也很高。

2.3.3 酒曲接種量對酒曲產GABA的影響 將米曲霉3.800以不同的接種量分別接種到冷卻到40℃左右的蒸米中制成酒曲，測量并比較酒曲中GABA含量和糖化酶活力，結果如圖4所示。

圖4 酒曲接種量對酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.4 Effect of spore amount on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

接種量直接影響酒曲中GABA含量。接種量較少，導致酒曲中米曲霉生物量少，酒曲中各項指標達不到標準，接種量多，蒸米含量有限不足以提供充足的營養成分。如圖4所示，接種量為40mg/100g(米曲霉質量/蒸米質量)時GABA最多為3.987mg/g，此時糖化酶活力也是最高的。

2.3.4 酒曲培養溫度對酒曲產GABA的影響 將米曲霉以40mg/100g蒸米的接種量接種到蒸米中后，采用不同的溫度變化方式培養酒曲，溫度變化方式對酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響見表2。

表2 酒曲的培養溫度變化方式對酒曲產GABA的影響Table 2 Effect of koji incubation temperature on the production of GABA in the koji

酒曲培養溫度是清酒品質的重要保證。35℃以下有利于提升蛋白酶的酶活，35℃以上有利于糖化酶活力的提高，而蛋白酶和糖化酶是評價酒曲質量的重要指標，因而變溫能兼顧到不同酶酶活的需要。谷氨酸脫羧酶屬于酸性蛋白酶，因而培養溫度在35℃以下有利于GABA富集，從表2可看出，在35℃恒溫下培養，富集的GABA最少。在培養酒曲過程中4次變化溫度最有利于富集GABA，糖化酶活力也達到標準要求。

表3 浸泡液中不添加和添加物質的大米做成酒曲而釀造的清酒中各項指標的比較Table 3 Comparison of sake brewing parameters between rice soaking water with additives and with no

2.3.5 L－谷氨酸鈉濃度對酒曲產GABA的影響 用含不同濃度的L－谷氨酸鈉水溶液過夜浸泡尚志長香米，溶液的質量是大米的二倍，浸泡液中L－谷氨酸鈉對酒曲產GABA的影響見圖5。

圖5 大米浸泡液中L－谷氨酸鈉濃度對酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.5 Effect of L－sodium glutamate concentration in rice soaking water on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

谷氨酸脫羧酶以谷氨酸為底物可以產生GABA，適當增加底物的濃度，有利于酒曲中GABA的轉化。由于L－谷氨酸的價格較貴，而L－谷氨酸鈉能夠轉化成底物谷氨酸，且價格低廉，適于作為富集GABA的底物。從圖5中可以看出，在浸泡大米的水溶液中谷氨酸鈉濃度為2.0mg/mL時酒曲中富集的GABA最多為5.859mg/g。

2.3.6 維生素C濃度對酒曲產GABA的影響 用含不同濃度的維生素C(簡稱VC)水溶液過夜浸泡尚志長香米，溶液的質量是大米的二倍，浸泡液中VC濃度對酒曲產GABA的影響見圖6。

谷氨酸脫羧酶為酸性蛋白酶，添加適量的弱酸有助于創造酸性環境，提高谷氨酸脫羧酶酶活，利于GABA轉化。同時GABA是生物體在逆境條件下緩解細胞酸化對自身毒害作用的產物，加入丁酸或其他弱酸均可促進GABA合成［13］。VC是食品級弱酸對人體無害，因此可選作浸泡大米水中的物質。如圖6所示，當VC濃度為7.5mg/mL時酒曲中GABA最多，可能由于此濃度下溶液的pH正好處于米曲霉3.800的谷氨酸脫羧酶的最適宜pH，使酶活最大。

2.4 清酒指標測定

分別用浸泡液中添加VC以及L－谷氨酸鈉和不添加以上兩種物質的大米做酒曲，然后釀造清酒。測定發酵過程中兩個酒醪中GABA含量的變化，測定并比較成品清酒中GABA濃度和各項理化指標，結果見圖7和表3。

圖6 大米浸泡液中維生素C濃度對酒曲中GABA含量和糖化酶活力的影響Fig.6 Effect of vitamin C concentration in rice soaking water on GABA content and saccharifying enzyme activities in the koji

圖7 清酒發酵過程中GABA濃度的變化Fig.7 Variation of GABA concentration during the fermentation

如圖7所示，用含有VC和谷氨酸鈉的水溶液浸泡的米作酒曲而釀造的清酒，在其發酵過程中發酵醪中GABA的含量始終高于無添加的。從圖7結果看出，在發酵前16d，兩個發酵醪中GABA含量隨著發酵的進行變化量很大;16d后，清酒基本成熟，GABA濃度增加緩慢，發酵醪中GABA濃度趨于穩定。添加VC和谷氨酸鈉獲得的酒曲GABA含量最多，為6.936mg/g，以此制得的清酒中GABA濃度如表3所示，為0.439mg/mL。從表3得出，兩個發酵酒醪成熟后得到的成品清酒GABA含量差別很大，而酒精度、總糖、總酸指標差別不大，說明在浸泡米水溶液中添加VC和L－谷氨酸鈉是可行的。

3 結論

不同的霉菌菌種和大米原料制成的酒曲中GABA含量差別較大，因此菌種和大米種類的選擇對于提高清酒中GABA是重要的。酒曲的培養方法也會影響清酒中GABA含量。通過向浸米水中加入能夠促進轉化GABA的物質可以提高清酒中GABA含量。本實驗篩選出米曲霉3.800和尚志長香米為原料制作富含GABA清酒酒曲，在原料確定的基礎上優化了酒曲工藝，優化條件為大米過夜浸泡于含有7.5mg/mL維生素C和2.0mg/mL L－谷氨酸鈉水溶液中后蒸煮，再將30℃下培養6d的米曲霉3.800以40mg/100g蒸米的接種量接種到蒸熟的米中制作酒曲，酒曲采用變溫培養，即在30℃培養20h，32℃培養4h，35℃培養14h，38℃培養8h。最終獲得的酒曲中γ－氨基丁酸含量為6.936mg/g酒曲，清酒中含量為0.439mg/mL。

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Study on koji with high content of gamma－aminobutyric

WU Dai－xi，WU Fei*
(College of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The varieties of rice and mold for making the koji with high content of gamma－aminobutyric(GABA)and high saccharifying enzyme activities were selected.Aspergillus oryzae 3.800 and rice from Shangzhi were selected as optimal combination，and the optimizing process conditions for koji to produce more GABA were studied.The results suggested that Aspergillus oryzae 3.800 was cultured for 6 days at 30℃ in PDA medium，and then put into steamed rice with 40mg/100g spore amount after rices were soaked in the water with 7.5mg/mL vitamin C and 2.0mg/mL sodium glutamate overnight，and more GABA was obtained after the koji was cultivated in the variable temperatures，just 30℃ for 20h，32℃ for 4h，35℃ for 14h，38℃ for 8h.6.936mg/g and 0.439mg/mL GABA were got in the koji and sake respectively in the above conditions.

gamma－aminobutyric;koji;sake;rice

TS262.4

A

1002－0306(2012)21－0188－05

2012－04－17 *通訊聯系人

吳岱熹(1987－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:農產品加。