姜料中抗壞血酸克呂沃爾菌特性及其產(chǎn)生亞硝酸鹽能力研究

賴曉芳，蘭全學(xué)，楊 俊，陳血建，肖仕偉，陳 晶，楊國武

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳 518131)

姜料中抗壞血酸克呂沃爾菌特性及其產(chǎn)生亞硝酸鹽能力研究

賴曉芳，蘭全學(xué)，楊 俊，陳血建，肖仕偉，陳 晶，楊國武*

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳 518131)

目的:研究從姜料分離的抗壞血酸克呂沃爾菌生理生化特性，及其在姜料中產(chǎn)生亞硝酸鹽的能力，分析即用姜料產(chǎn)生亞硝酸鹽的原因及規(guī)律。方法:進(jìn)行抗壞血酸克呂沃爾菌生化實驗，觀察該菌在不同冷藏溫度、氯化鈉濃度和pH的生長情況，用該菌污染姜料后分析姜料的亞硝酸鹽變化規(guī)律。結(jié)果:抗壞血酸克呂沃爾菌硝酸鹽還原實驗陽性;在1、4℃培養(yǎng)時會逐漸減少直至全部死亡，在8℃會緩慢生長;氯化鈉濃度為1%和2%的培養(yǎng)基適合其繁殖;在pH4.0的培養(yǎng)基中會逐步死亡，pH5.0、6.0適合其繁殖;姜料中抗壞血酸克呂沃爾菌總數(shù)增長到108CFU/g時，多數(shù)姜料中亞硝酸鹽含量達(dá)到峰值。結(jié)論:抗壞血酸克呂沃爾菌具有硝酸鹽還原能力，在4℃以下不會生長繁殖，其生長的適宜氯化鈉濃度為1%～2%，適宜pH為5.0～6.0，抗壞血酸克呂沃爾菌的大量繁殖可以導(dǎo)致姜料中亞硝酸鹽大量產(chǎn)生。

抗壞血酸克呂沃爾菌，生理生化特性，亞硝酸鹽

有文獻(xiàn)指出，蔬菜存放過程中產(chǎn)生亞硝酸鹽，是由于硝酸鹽還原細(xì)菌大量繁殖將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽所致［1－2］，但具體由哪些細(xì)菌引起，尚未見到相關(guān)報道。克呂沃爾菌屬在1981年由Farmer等正式確認(rèn)，屬于腸桿菌科，包括抗壞血酸、棲冷、佐治亞、蝸牛克呂沃爾菌4個種，可存在于食物、土壤和污水中［3］。目前，國內(nèi)外只有極少量的關(guān)于克呂沃爾菌引起臨床感染病例的報道，未見到關(guān)于抗壞血酸克呂沃爾菌生理生化特性以及其引起蔬菜中亞硝酸鹽大量積聚的報道［4－7］。1～10℃是蔬菜在許多家庭和餐飲服務(wù)企業(yè)常見的冷藏溫度［8－9］，分析抗壞血酸克呂沃爾菌在不同冷藏溫度的生長特性，對于預(yù)防和控制蔬菜中亞硝鹽的產(chǎn)生具有重要指導(dǎo)意義。本研究以從即用嫩姜姜蓉(亞硝酸鹽含量高達(dá)160mg/kg (以N計))中分離的一株抗壞血酸克呂沃爾菌作為研究對象。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

抗壞血酸克呂沃爾菌 從一份即用嫩姜姜蓉(亞硝酸鹽含量160mg/kg，以N計)分離;營養(yǎng)肉湯、平板計數(shù)瓊脂 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;硝酸鹽、亞硝酸鹽快速測定試劑條(反應(yīng)墊上為固體格利斯試劑對氨基苯磺酰胺和N－1萘基乙二胺) 美國Industrial Test Systems公司。

表1 抗壞血酸克呂沃爾菌生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 Biochemical reaction of Kluyveraascorbata

VITEK2 Compact全自動微生物鑒定儀、Vitek2 GN鑒定卡 法國生物梅里埃公司;SHP－250生化培養(yǎng)箱 中國上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗壞血酸克呂沃爾菌的分離 以一份亞硝酸鹽含量為160mg/kg的仔姜姜蓉為材料，分別涂布血平板、普通瓊脂平板，在需氧、微需氧、厭氧條件下37℃進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，在各培養(yǎng)條件下得到的兩種平板上長出的菌落形態(tài)和菌落分布相似。通過對各種菌落的純化培養(yǎng)和生化鑒定，鑒定出在姜蓉中數(shù)量上占絕對優(yōu)勢的細(xì)菌為抗壞血酸克呂沃爾菌。

1.2.2 抗壞血酸克呂沃爾菌的生化特性分析 將菌株革蘭氏染色，用全自動微生物鑒定儀VITEK 2 Compact進(jìn)行生化鑒定。將抗壞血酸呂沃爾菌接種于硝酸鹽肉湯生化管中，37℃培養(yǎng)24h，加入硝酸鹽還原甲、乙液，觀察顏色變化，檢測該菌的硝酸鹽還原能力。

1.2.3 抗壞血酸克呂沃爾菌在不同冷藏溫度的生長特性 培養(yǎng)液為營養(yǎng)肉湯(pH7.0)，將初始濃度為102、104、106CFU/m L的抗壞血酸克呂沃爾菌培養(yǎng)基分別置于1、4、8℃條件下培養(yǎng)，間隔一定時間對菌液進(jìn)行平板菌落計數(shù)。

1.2.4 抗壞血酸克呂沃爾菌在不同鹽濃度的生長特性 配制氯化鈉濃度分別為0.5%、1%、2%、5%、10%、20%的營養(yǎng)肉湯(pH7.0)培養(yǎng)液，將含終濃度102CFU/m L的抗壞血酸克呂沃爾菌上述營養(yǎng)肉湯于8℃培養(yǎng)，間隔一定時間進(jìn)行平板菌落計數(shù)。

1.2.5 抗壞血酸克呂沃爾菌在不同pH條件下的生長特性 配制pH4.0、5.0、6.0、7.0的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，將含終濃度102CFU/m L的抗壞血酸克呂沃爾菌上述營養(yǎng)肉湯于8℃培養(yǎng)，間隔一定時間進(jìn)行平板菌落計數(shù)。

1.2.6 抗壞血酸克呂沃爾菌模擬污染姜料后亞硝酸鹽產(chǎn)生規(guī)律 將8個來源于不同產(chǎn)地的仔姜品種機(jī)械粉碎制成姜蓉，100℃蒸汽滅菌30min，測定8個仔姜樣品的初始硝酸鹽含量，分別污染終濃度為105～106CFU/g的抗壞血酸克呂沃爾菌，8個仔姜樣品均設(shè)置不加細(xì)菌的對照。將上述處理過的仔姜姜蓉置于8℃條件下存放，間隔一定時間測定姜蓉中亞硝酸鹽值和菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗壞血酸呂沃爾菌的生化特性結(jié)果

該菌在血平板和普通瓊脂平板上形成圓形菌落，直徑約2～3mm，灰白色、光滑、濕潤、不溶血;革蘭染色陰性，菌體呈桿狀，無芽孢。生化反應(yīng)結(jié)果見表1。菌株在有氧、厭氧情況下均可生長，為兼性厭氧菌。抗壞血酸呂沃爾菌可使硝酸鹽肉湯顏色變?yōu)榧t色，硝酸鹽還原實驗陽性。

2.2 抗壞血酸克呂沃爾菌在不同冷藏溫度下的生長特性

培養(yǎng)時間為0d的細(xì)菌濃度為初始培養(yǎng)濃度，由表2～表4可見，102、104、106CFU/m L三種初始濃度的抗壞血酸克呂沃爾菌，在1℃和4℃培養(yǎng)溫度不能繁殖，細(xì)菌濃度逐日減少，一段時間后該菌基本全部死亡。當(dāng)菌濃度為102CFU/m L時，基本全部死亡的時間為5d;當(dāng)菌濃度為104CFU/m L時，基本全部死亡的時間為7d;當(dāng)菌濃度為106CFU/m L時，基本全部死亡的時間為16～26d。

當(dāng)培養(yǎng)溫度為8℃時，三種濃度抗壞血酸克呂沃爾菌均可緩慢生長，102、104、106CFU/mL菌液分別在培養(yǎng)第17、11、2d后達(dá)到107CFU/mL濃度，106CFU/mL菌液在培養(yǎng)4d后高達(dá)108CFU/m L。

表2 抗壞血酸克呂沃爾菌生長實驗結(jié)果(1℃)Table 2 Growth test results of Kluyveraascorbata(1℃)

表3 抗壞血酸克呂沃爾菌生長實驗結(jié)果(4℃)Table 3 Growth test results of Kluyveraascorbata(4℃)

2.3 抗壞血酸克呂沃爾菌在不同鹽濃度條件下的生長特性

由表5可見，初始細(xì)菌濃度為102CFU/m L的菌液(培養(yǎng)時間為0d)，當(dāng)氯化鈉濃度為0.5%時，抗壞血酸克呂沃爾菌在培養(yǎng)到第8d時菌濃度增加一個數(shù)量級，到第10d時濃度增加為104CFU/m L。當(dāng)氯化鈉濃度為1%、2%時，102CFU/m L的菌液在培養(yǎng)11d后濃度增加至107CFU/m L，細(xì)菌在氯化鈉濃度為1%、2%條件下的繁殖速度明顯快于0.5%。當(dāng)氯化鈉濃度為5%時，該菌培養(yǎng)3d后死亡。當(dāng)氯化鈉濃度為10%、20%時，該菌在培養(yǎng)1d后即死亡。

表4 抗壞血酸克呂沃爾菌生長實驗結(jié)果(8℃)Table 4 Growth test results of Kluyveraascorbata(8℃)

2.4 抗壞血酸克呂沃爾菌在不同pH條件下的生長特性

由表6可見，初始細(xì)菌濃度為102CFU/m L的菌液(培養(yǎng)時間為0d)，在pH4.0條件下培養(yǎng)，細(xì)菌數(shù)量迅速減少，第8d后全部死亡;在pH5.0、6.0、7.0條件下菌濃度均緩慢增加，pH5.0、6.0條件下的菌濃度增加速度快于pH7.0。

表6 抗壞血酸克呂沃爾菌在不同pH環(huán)境下的生長實驗結(jié)果(8℃)Table 6 Growth test results of Kluyveraascorbata in different pH(8℃)

2.5 抗壞血酸克呂沃爾菌模擬污染姜料后亞硝酸鹽的產(chǎn)生規(guī)律

由表7～表8可見，滅菌的8個品種姜料在人工污染抗壞血酸呂沃爾菌后，在8℃放置，有7個品種姜料在3～5d內(nèi)開始檢出亞硝酸鹽，其中黃姜的亞硝酸鹽濃度在第6d高達(dá)160mg/kg(以N計)。廣東大姜檢出亞硝酸鹽時間相對較遲，在第9d才檢出。

測定亞硝酸鹽的同時監(jiān)測細(xì)菌數(shù)量的變化。由表7、表9可見，多數(shù)樣品當(dāng)菌落總數(shù)達(dá)到107CFU/g時亞硝酸鹽開始檢出，菌落總數(shù)為108CFU/g時，亞硝酸鹽值達(dá)到峰值。未染菌的滅菌姜料在存放13d后未檢出亞硝酸鹽，菌落計數(shù)保持為＜10CFU/g。

表5 抗壞血酸克呂沃爾菌在不同鹽濃度的生長實驗結(jié)果(8℃)Table 5 Growth test results of Kluyveraascorbata in different salt concentration(8℃)

表7 不同姜料的亞硝酸鹽濃度變化實驗(8℃)Table 7 Nitrite concentration change of different gingermaterials(8℃)

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)抗壞血酸克呂沃爾菌可在8℃大量繁殖，并通過模擬污染實驗確證了該菌可導(dǎo)致姜蓉產(chǎn)生較高濃度的亞硝酸鹽。

實驗結(jié)果表明，在4℃以下抗壞血酸克呂沃爾菌數(shù)量逐漸減少直至全部死亡，菌含量越少其死亡時間越短;在8℃抗壞血酸克呂沃爾菌緩慢生長，菌含量越高繁殖速度越快。因此，將蔬菜冷藏溫度控制在4℃以下，可以有效抑制該菌的生長繁殖，避免大量繁殖引起的亞硝酸鹽積累。

表8 不同來源仔姜姜蓉亞硝鹽峰值Table 8 Nitrite concentration peak value of different gingermaterials

表9 不同姜料中菌落總數(shù)的變化實驗(8℃)Table 9 Aerobic plate count of different gingermaterials(8℃)

抗血酸克呂沃爾菌在氯化鈉濃度為0.5%時，初期繁殖速度較為緩慢;氯化鈉濃度為1%和2%時，繁殖速度相對較快;氯化鈉濃度為高于5%時，該菌不能生長。如若要腌制蔬菜，掌握好食鹽濃度有利于控制抗壞血酸克呂沃爾菌大量繁殖。

抗壞血酸克呂沃爾菌在 pH4.0不能繁殖，在pH5.0～7.0可緩慢生長。本研究中的姜料pH在5.0～7.0，為該菌在姜料中大量繁殖提供了條件。蔬菜pH一般在4.0～7.0，大多數(shù)蔬菜為該菌的生長繁殖提供了適宜的pH。

模擬污染實驗數(shù)據(jù)顯示，抗壞血酸克呂沃爾菌可以在8℃姜料中大量繁殖，大多數(shù)姜中菌落總數(shù)從107CFU/g增長到108CFU/g時，亞硝酸鹽相應(yīng)從開始檢出達(dá)到峰值，亞硝酸鹽峰值為20～160mg/kg，沒有染菌的滅菌姜樣品始終不能檢出亞硝酸鹽。結(jié)果充分證明了由于抗壞血酸克呂沃爾菌的大量繁殖，將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，導(dǎo)致了姜料中大量亞硝酸鹽的積聚，而且亞硝酸鹽含量可以達(dá)到很高水平。本研究中未觀察到姜料中初始硝酸鹽濃度與亞硝酸鹽峰值之間存在高低對應(yīng)關(guān)系，提示細(xì)菌的繁殖情況是影響亞硝酸鹽含量的關(guān)鍵因素。

我國膳食中80%左右的亞硝酸鹽來自蔬菜［10］，控制蔬菜的亞硝酸鹽含量，對保護(hù)人類健康具有重要意義。本研究結(jié)果表明，控制冷藏溫度、食鹽濃度可有效預(yù)防該菌在蔬菜中生長繁殖，避免亞硝酸鹽的大量產(chǎn)生。

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Characteristics and nitrate producing capacity of Kluyvera ascorbata isolated from ginger

LAIXiao－fang，LAN Quan－xue，YANG Jun，CHEN Xue－jian，XIAO Shi－wei，CHEN Jing，YANG Guo－wu*
(Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection，Shenzhen 518131，China)

Ob jective:To analyze the physiological and biochem ical characteristics and nitrate p roducing capability of Kluyvera ascorbata isolated from ginger.To exp lore reasons and rules for nitrite p roduc tion in ginger.Methods: Biochem ical characteristics were tested.The grow th of Kluyvera ascorbata was observed in different tem perature，concentration of sodium chloride and pH.Nitrite concentration change in gingerwere determ inated after gingerwas contam inated by Kluyvera ascorbata.Result:The nitrate reducing test of Kluyvera ascorbata was positive.Kluyvera ascorbata d ied g radually at 1℃，4℃and pH4.0.However，it could grow slow ly at 8℃，1%sodium chloride，2% sod ium chloride，pH5.0 and pH6.0 in culture m ed ium.Nitrite concentration was at peak when the number of Kluyvera ascorbata was 108CFU/g in most of ginger.Conclusion:Kluyvera ascorbata had nitrate reduc tion capacity.Kluyvera ascorbata couldn’t g row below 4℃.The ideal g row th conditions were at 1%～2%sodium chloride and pH5.0～6.0.Mass p ropagation of Kluyvera ascorbata could lead to generate high nitrite concentration in ginger.

Kluyvera ascorbata;physiological and b iochem ical charac teristics;nitrite

TS201.6

A

1002－0306(2012)19－0063－05

2012－03－16 *通訊聯(lián)系人

賴曉芳(1964－)，女，碩士，高級工程師，主要從事化學(xué)檢測與管理工作。