丁香多酚細(xì)胞抗氧化活性的研究

張慧蕓，申云翔，任國(guó)艷

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003)

丁香多酚細(xì)胞抗氧化活性的研究

張慧蕓，申云翔，任國(guó)艷

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003)

目的:研究丁香多酚對(duì)由H2O2引起的人肝細(xì)胞RBL氧化損傷的保護(hù)作用。方法:采用H2O2誘導(dǎo)建立細(xì)胞氧化損傷模型，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞抗氧化酶活性、丙二醛等指標(biāo)，分析探討丁香多酚對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果:結(jié)果表明，100μmol/L H2O2孵育24h可顯著誘導(dǎo)RBL細(xì)胞損傷，使細(xì)胞存活力下降到24.64%，細(xì)胞經(jīng)不同濃度的丁香多酚(0.1、0.5、2、10mg/L)與H2O2共孵育后，特別是10mg/L丁香多酚可使細(xì)胞存活率達(dá)到59.18%。丁香多酚可通過(guò)提高SOD、CAT、GSH－Px酶活性，降低MDA含量，促進(jìn)受損的RBL細(xì)胞修復(fù)。結(jié)論:丁香多酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的RBL細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，可作為食源性抗氧化劑。

丁香多酚，抗氧化能力，人肝細(xì)胞，過(guò)氧化氫，保護(hù)作用

隨著自由基和抗氧化劑理論和研究工作的深入，自由基與疾病、衰老的關(guān)系及其自由基清除劑、抗氧化劑的研究逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，然而合成抗氧化劑因?yàn)樵絹?lái)越多的被發(fā)現(xiàn)有諸多的副作用，高效、低毒的天然抗氧化劑的研究和應(yīng)用越來(lái)越引起人們的重視。植物多酚是一種良好的天然抗氧化劑，其抗氧化功能已經(jīng)得到廣泛肯定［1］。目前多酚物質(zhì)生理活性的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。已經(jīng)有許多實(shí)驗(yàn)證明，多酚物質(zhì)在體內(nèi)具有良好的抗氧化活性，在心腦血管疾病、抗衰老和抑制腫瘤等方面有明顯的預(yù)防和治療效果［2－5］。茶多酚、蘋(píng)果多酚和葡萄多酚等植物多酚的體外生物活性已有大量實(shí)驗(yàn)研究［6－9］。丁香為桃金娘科植物丁香(Eugeniacaryophylla Thunb.)的干燥花蕾，是藥食兩用植物。研究表明，丁香具有眾多功能活性［10－12］。Peter等人［13］報(bào)道，丁香中的丁香酚、異丁香酚以及沒(méi)食子酸等都是重要的抗氧化成分。Chaieb等人［14］提取丁香中的抗氧化物質(zhì)，進(jìn)行鑒定得到主要的抗氧化物質(zhì)為丁子香酚和沒(méi)食子酸。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于丁香在化學(xué)體系中抗氧化活性研究方面已有較多報(bào)道［15－20］，但極少涉及對(duì)細(xì)胞抗氧化活性方面的研究。通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，丁香多酚提取物在體外具有較好的抗氧化和清除自由基活性［21］，為了進(jìn)一步考察其抗氧化生理功能，本研究主要探討丁香多酚對(duì)人肝細(xì)胞RBL H2O2損傷后的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丁香 洛陽(yáng)好一生大藥房;人肝細(xì)胞RBL 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);含青霉素和鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)液 PBS Solarbio公司;0.25%胰酶－EDTA消化液、胎牛血清、DMEM(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium)培養(yǎng)基 Gibco公司;二甲基亞砜(DMSO)溶解后避光保存?zhèn)溆谩⑧邕蛩{(lán)(3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazoliumbrom ide，MTT) Sigma公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－Px)試劑盒 南京建成生物工程公司。

Model 680酶標(biāo)儀 BIO－RAD公司;HF－90 CO2培養(yǎng)箱 力康發(fā)展有限公司;UV－2401PC紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;SinChrom ODS－BP柱(250mm×4.6mm) 大連伊利特;D－1320超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丁香多酚提取物的制備方法 將干燥并碾磨成粉狀的丁香取10g，于250m L三頸瓶中，加入濃度為60%的乙醇100m L，水浴加熱溫度為50℃，攪拌器攪拌，提取時(shí)間2h，浸出液10000×g離心15m in，沉淀重新用60%乙醇提取，將第二次的提取液10000×g離心15m in，上清液合并后50℃減壓濃縮至干，取出濃縮液進(jìn)行真空干燥(40℃、0.07MPa)得到丁香多酚提取物，4℃冰箱保存。測(cè)定前將樣品溶于60%乙醇至所需濃度，經(jīng)0.22μm微孔膜過(guò)濾滅菌。

1.2.2 RBL細(xì)胞培養(yǎng)與處理 RBL細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM，含10%胎牛血清(FBS)、100g/m L雙抗、2mmol/L谷胺酰胺，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)用0.25%的胰蛋白酶消化，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，接種密度2.0×105個(gè)/m L，培養(yǎng)24h后分組培養(yǎng)。正常對(duì)照組:細(xì)胞，不加任何處理;模型組:細(xì)胞+100μmol/L H2O2(H2O2單獨(dú)處理24h);樣品防護(hù)組:細(xì)胞+樣品+100μmol/LH2O2(不同濃度的樣品與H2O2同時(shí)加入，并共孵24h);樣品對(duì)照組:細(xì)胞+樣品(樣品單獨(dú)處理24h)。

1.2.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 細(xì)胞存活率檢測(cè):MTT法［22］。96孔板中的細(xì)胞分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加20μL(5mg/m L)MTT，培養(yǎng)3.5h后棄上清，每孔加150μL DMSO，充分振蕩溶解紫色結(jié)晶，于570nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值。由MTT轉(zhuǎn)化為不可溶formazan鹽的數(shù)量可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)存活率。對(duì)照組細(xì)胞形成formazan的OD相當(dāng)于100%存活率。處理組細(xì)胞存活率結(jié)果表示為測(cè)定組OD和對(duì)照組OD的百分比。

1.2.4 細(xì)胞裂解液的制備 細(xì)胞裂解液的制備參照Lee等［23］的方法，稍加改動(dòng)。細(xì)胞以1.2×104個(gè)/m L密度接種于24孔板。于37℃培養(yǎng)16h后，將不同濃度的樣品(0.1、0.5、2和10mg/L)加入孔板中。于37℃培養(yǎng)24h后，每孔加入150μL細(xì)胞裂解液(1% triton X－100)，于4℃裂解12h后測(cè)定酶活。細(xì)胞裂解液的蛋白質(zhì)含量由考馬斯亮蘭法測(cè)定。酶活表示為U/mg蛋白。

1.2.5 氧化還原酶系及MDA含量的測(cè)定 收集各組處理后的細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解液(細(xì)胞收集后經(jīng)－20℃與室溫下反復(fù)凍融三次)。細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞裂解液的CAT、SOD和GSH－Px水平均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。MDA含量用硫代巴比妥酸(TBARS)方法測(cè)定［24］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 Statistix 8.1(分析軟件，St Paul，MN)利用軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性(p＜0.05)分析使用Tukey HSD程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香多酚對(duì)RBL存活率的影響

圖1為丁香多酚對(duì) H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的RBL細(xì)胞存活率的影響，由圖可以看出，與正常對(duì)照比，H2O2可顯著誘導(dǎo)RBL細(xì)胞損傷，只經(jīng)H2O2處理的模型對(duì)照組使細(xì)胞存活率下降到24.64%。隨著丁香多酚添加量的提高，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用增強(qiáng)，樣品防護(hù)組中丁香多酚以0.1、0.5、2mg/L濃度與H2O2共孵時(shí)，細(xì)胞存活率分別提高了 9.72%、20.84%和27.74%(p＜0.05);當(dāng)濃度為10mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率從24.64%提高到了59.18%(p＜0.01)。另外，從樣品對(duì)照組與正常對(duì)照組相比較可以看出，樣品有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，丁香多酚濃度為2mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率提高了10.94%，效果顯著(p＜0.05);丁香多酚濃度為10mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率增加了17.59%，效果非常顯著(p＜0.01)。

圖1 丁香多酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的RBL細(xì)胞存活率的影響Fig.1 The effect of clove polyphenols on H2 O2－induced oxidative damage in RBL cells viability

H2O2極易透過(guò)細(xì)胞膜，可在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)多種反應(yīng)而形成高活性自由基，最終對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害［25］，因此H2O2已成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具。H2O2對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷的體現(xiàn)主要是細(xì)胞存活率的改變。由于MTT法測(cè)細(xì)胞存活率方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，所需細(xì)胞數(shù)目較少，已成為檢測(cè)活細(xì)胞和細(xì)胞增殖的一個(gè)主要手段。本實(shí)驗(yàn)的MTT結(jié)果表明，與正常對(duì)照相比，丁香多酚在0.1～10mg/L濃度范圍內(nèi)，均可對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。經(jīng)丁香多酚保護(hù)后的細(xì)胞存活率提高，且丁香多酚通過(guò)抗氧化機(jī)制，淬滅氧自由基，減輕了自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［12］。除此之外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一定濃度的丁香多酚具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

2.2 丁香多酚對(duì)RBL細(xì)胞抗氧化酶系的作用

為了研究丁香多酚是否具有提高抗氧化酶系統(tǒng)活力的作用，測(cè)定了丁香多酚處理后RBL細(xì)胞的CAT、SOD和GSH－Px酶的活力。由圖2可知，正常對(duì)照組CAT、SOD和GSH－Px酶的活力均在較高水平，經(jīng)H2O2處理24h后，模型組的這些指標(biāo)顯著下降(p＜0.05)，而丁香多酚均可以劑量依賴(lài)性的提高其活性。濃度為0.1～10mg/L的丁香多酚作用后的細(xì)胞中的三種酶含量均顯著高于損傷對(duì)照組(p＜0.05)。

圖2 丁香多酚對(duì)氧化損傷的RBL內(nèi)CAT、SOD和GSH－Px酶活力的影響Fig.2 The effect of clove polyphenols on the activityof CAT、SOD and GSH－Px of injured RBL

機(jī)體內(nèi)存在大量具有清除自由基功能的抗氧化酶系，在抵抗細(xì)胞和組織氧化損傷方面發(fā)揮著重要的作用［26］，包括SOD、CAT和GSH－Px在內(nèi)的抗氧化酶可通過(guò)攻擊自由基來(lái)調(diào)節(jié)各種疾病的產(chǎn)生。研究表明［27］SOD、GSH－Px、CAT水平是衡量機(jī)體及細(xì)胞氧化損傷的重要指標(biāo)。本研究中 H2O2模型組的SOD、CAT和GSH－Px活性下降，而丁香多酚處理后各組的抗氧化酶活性均有所提高，表明丁香多酚可通過(guò)抗氧化生理功能，提高細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的活性水平，從而減輕了自由基對(duì)細(xì)胞的損傷。

2.3 丁香多酚對(duì)RBL細(xì)胞中MDA含量的影響

不同濃度丁香多酚清除MDA的結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可以看出，濃度為0.1～10mg/L的丁香多酚對(duì)MDA均有明顯的清除作用，隨丁香多酚濃度的增加，MDA含量呈下降趨勢(shì)(p＜0.05)，模型組的MDA含量與正常對(duì)照組相比顯著升高(p＜0.05)，而樣品防護(hù)組中MDA水平比模型組低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且10mg/L的樣品防護(hù)組水平與正常對(duì)照組相當(dāng)。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物使組織細(xì)胞受損傷，即MDA的含量間接反映細(xì)胞的受損程度［28］。從MDA含量變化可以看出，丁香多酚可在一定程度上阻止生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，從而防護(hù)了細(xì)胞的脂質(zhì)膜。

圖3 丁香多酚對(duì)氧化損傷的RBL內(nèi)MDA含量的影響Fig.3 The effect of clove polyphenols on the MDA content of injured RBL

3 結(jié)論

丁香多酚可在適宜濃度下對(duì)由H2O2誘導(dǎo)引起的RBL細(xì)胞氧化損傷起到保護(hù)作用，并且可以劑量依賴(lài)性地顯著提高細(xì)胞中抗氧化酶SOD、GSH－Px和CAT的活性，降低MDA含量，同時(shí)促進(jìn)RBL細(xì)胞生長(zhǎng)。因而丁香多酚具有潛在的生理功能和廣闊的應(yīng)用前景。

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Study on the antioxidant capacity of clove polyphenols in cell

ZHANG Hui－yun，SHEN Yun－xiang，REN Guo－yan
(College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China)

Ob jective:A study was conducted to investigate the p rotective effects of c love polyphenols extracts on RBL caused by the damage of H2O2and its p rotective mechanism.Method:Oxidative damage was induced by H2O2，and cell viab ility was m easured by the MTT assay.The influence of c love polyphenols extrac ts on H2O2induced RBL injury was assessed by measuring the superoxide d ismutase(SOD)，catalase(CAT)，and g lutathione peroxidase(GSH－Px)ac tivities and the malond ialdehyde(MDA)content.Result:The results demonstrated that RBL cells were damaged by incubation w ith 100μm ol/L H2O2for 24h，and the viability of RBL cells reduced to 24.64%.The add ition of c love polyphenols extrac ts(0.1，0.5，2 and 10m g/L)into the RBL cell suspensions p rior to the exposure to 100μmol/L of H2O2resulted in a greater survival rate of the cells.In particular，the cell viability reached 59.18%after treating w ith 10mg/L c love polyphenols extrac ts.Moreover，at elevated concentrations，c love polyphenols extrac ts exhibited inc reased repairing capability for injured RBL as well as inc reased p rotec tion of SOD，CAT and GSH－PX while reduced MDA formation.Conc lusion:The c love polyphenols extrac ts possessed p rotec tive effec ts on RBL cell injuries induced by H2O2，and this may be related to the antioxidative activity of c love polyphenols.

c love polyphenols;antioxidant capacity;RBL;H2O2;p rotec tion

TS201.2

A

1002－0306(2012)19－0147－04

2012－03－20

張慧蕓(1977－)，女，博士，副教授，研究方向:畜產(chǎn)品加工。