微生物分離玉米皮水解液中L－阿拉伯糖的研究

鄒鴻菲，張澤生，*，鄭 敏

(1.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)，天津 300457; 2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

微生物分離玉米皮水解液中L－阿拉伯糖的研究

鄒鴻菲1，2，+，張澤生1，2，+，*，鄭 敏1，2

(1.食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)，天津 300457; 2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

比較幾株酵母菌和霉菌對玉米皮水解液中L－阿拉伯糖的分離情況，從中選出能夠快速利用葡萄糖和木糖，難以利用L－阿拉伯糖的菌株。選用5株酵母菌，7株霉菌和自環(huán)境中分離篩選出的2株霉菌經(jīng)模擬培養(yǎng)基發(fā)酵后篩選出5株菌進(jìn)行對玉米皮水解液的發(fā)酵。結(jié)果表明，球擬酵母發(fā)酵4d，綠木霉、灰霉和自環(huán)境中分離篩選出的霉菌Mgb1、Mgb2發(fā)酵3d后，玉米皮水解液中木糖的保留率均小于5%，L－阿拉伯糖的保留率可達(dá)75%以上。分離方法簡單有效，所用的3種菌株常見易得，為微生物法分離L－阿拉伯糖提供了一定的參考。

玉米皮水解液，L－阿拉伯糖，球擬酵母，綠木霉，灰霉

L－阿拉伯糖(L－Arabinose)是一種戊醛糖，在自然界中主要以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳糖體及類似于高等植物半纖維的形式存在［1］，它最具代表性的作用是能夠選擇性地抑制分解蔗糖的蔗糖酶，從而減少蔗糖的吸收和新脂肪的生成［2－3］，如果在日常食用的蔗糖中添加3%的L－阿拉伯糖可以抑制約60%的蔗糖吸收。作為玉米淀粉加工副產(chǎn)物的玉米皮中半纖維素的含量可高達(dá)38% (以干物質(zhì)計)［4］，其中絕大部分為阿拉伯木聚糖，且價格低廉，廣泛易得，是提取L－阿拉伯糖的優(yōu)良原料。在L－阿拉伯糖的分離方面，用樹脂或薄層色譜板進(jìn)行分離操作復(fù)雜且收效小，提取到的L－阿拉伯糖產(chǎn)率低，工業(yè)化難度大［5］。使用微生物法分離L－阿拉伯糖具有選擇性高，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，無污染等優(yōu)點，因此具有很大的應(yīng)用潛力與廣闊的發(fā)展前景［6］。本工作擬利用一些常見的酵母菌和霉菌菌種，考察其對玉米皮水解液中3種主要單糖葡萄糖、木糖和L－阿拉伯糖的利用情況，選出具有選擇性利用木糖的菌株，為今后微生物法分離L－阿拉伯糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供有效易得的菌株材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米皮 河北德瑞淀粉有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、木糖標(biāo)準(zhǔn)品、L－阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純，Sigma公司;魯式酵母(Saccharomycesrouxii)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青島酵母、球擬酵母(Torulopsis)，綠 木 霉 (Trichodermaspp)、腐 霉(Pythium)、灰霉 (Botrytiscinerea)、交鏈孢霉(Alternaria)、黑 曲 霉 (Aspergillusniger)、青 霉(Penicillium)、鐮刀霉(Fusarium) 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院菌種保藏中心;畢赤酵母(Pichiapastoris) 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏中心;酵母菌種子培養(yǎng)基(YEPD) 酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然;霉菌種子培養(yǎng)基(PDA) 馬鈴薯200g，切塊煮沸30m in后取濾液，葡萄糖20g，補水至1000m L，pH自然;酵母菌模擬培養(yǎng)基 酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖10g/L，L－阿拉伯糖6.67g/L，葡萄糖3.33g/L，pH自然;霉菌模擬培養(yǎng)基 馬鈴薯200g，切塊煮沸30m in后取濾液，木糖10g，L－阿拉伯糖6.67g，葡萄糖3g，補水至1000m L，pH自然;木糖基本培養(yǎng)基 木糖20g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO41g/L，Mg2SO4·7H2O 0.5g/L，瓊脂2g/L，pH6.0;玉米皮水解液培養(yǎng)基 玉米皮酸水解液中加入0.5%(NH4)2SO4，0.1%KH2PO4，0.05%Mg2SO4·7H2O，pH調(diào)至各菌所需值。

CTO－20A高效液相色譜儀、RID－10A示差折光檢測器、SCR－101C色譜柱 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米皮水解液的制備 玉米皮粉碎后過60目篩，烘干待用。稱取30g玉米皮粉碎物置于500m L圓底燒瓶內(nèi)，加入300m L 3%H2SO4水溶液攪勻，90℃下浸提2.5h。過濾后向酸水解液中加入CaCO3粉末中和至各菌種適宜發(fā)酵的pH［7］，將中和產(chǎn)生的CaSO4固體過濾除去，得玉米皮酸水解液。

1.2.2 常見菌種的篩選 菌株經(jīng)斜面活化后，轉(zhuǎn)接至3m L模擬培養(yǎng)基中活化。酵母30℃，霉菌28℃，150 r/m in搖床培養(yǎng)24h后，以10%(V/V)的接種量接入到裝有30m L模擬培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，150 r/m in搖床發(fā)酵培養(yǎng)，各菌種發(fā)酵培養(yǎng)溫度同其活化培養(yǎng)溫度。每隔24h取樣，采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中各單糖含量。

1.2.3 從環(huán)境中篩選菌種 取天津科技大學(xué)校園內(nèi)銀杏樹嫩葉1g，剪碎后加入到10m L無菌水內(nèi)，振蕩片刻。無菌操作，取1m L振蕩液，加入裝有9m L無菌水的試管中，振蕩均勻后，吸取100μL木糖基本培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，倒置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48h后挑取平板內(nèi)形狀規(guī)則、直徑較大的霉菌單菌落進(jìn)行分離純化，得到兩株霉菌，命名為 Mgb1和Mgb2。經(jīng)斜面和模擬培養(yǎng)基活化后以10%的接種量接入到裝有30m L模擬培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，28℃ 150 r/m in搖床發(fā)酵培養(yǎng)。每隔24h取樣，采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中各單糖含量。

1.2.4 玉米皮酸水解液的發(fā)酵 選定的幾株菌經(jīng)活化培養(yǎng)后以10%的接種量接入到裝有30m L玉米皮水解液培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，150 r/m in搖床發(fā)酵培養(yǎng)。每隔24h取樣，采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中各單糖含量。

1.2.5 單糖含量測定 高效液相色譜法(HPLC)。色譜條件:色譜柱:島津shim－pack SCR－101C;流動相:三重蒸餾水;柱溫:80℃;流速:0.8m L/m in。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米皮水解液的測定

將制備的玉米皮酸水解液用高效液相色譜法進(jìn)行成分分析。水解液中單糖液相色譜圖見圖1，圖1中葡萄糖、木糖和L－阿拉伯糖的保留時間分別為8.49、9.33和10.58min，其含量分別為6.1%、18.8%、11.3%(以玉米皮干物質(zhì)計)。

圖1 水解液中各組分單糖的HPLC圖Fig.1 HPLC ofmonosaccharides in hydrolyzate

2.2 常見菌種篩選結(jié)果

依據(jù)玉米皮酸水解液中各單糖組分的含量設(shè)計模擬培養(yǎng)基，即葡萄糖∶木糖∶L－阿拉伯糖的含量比值接近1∶3∶2。按照1.2.5的方法比較5種酵母、7種霉菌發(fā)酵過程中對三種單糖的利用情況。挑選出能快速大量利用木糖但基本不利用L－阿拉伯糖的菌株，用于之后對玉米皮酸水解液的發(fā)酵。

2.2.1 酵母菌篩選結(jié)果 實驗結(jié)果表明，5種酵母在發(fā)酵1d之后基本能將葡萄糖完全利用，其消耗木糖情況見圖2，消耗L－阿拉伯糖見圖3。

圖2 酵母菌發(fā)酵液木糖含量對比Fig.2 Comparation of xylose content in yeast fermentation broth

由圖2可知，青島酵母和釀酒酵母基本不利用木糖，魯式酵母對木糖的消耗速率較慢，發(fā)酵6d之后木糖只消耗了約50%。畢赤酵母能夠在發(fā)酵6d后基本將木糖消耗完全，球擬酵母在發(fā)酵3d后基本將木糖消耗完全，發(fā)酵4d后已檢測不到木糖的殘留。

由圖3可知，在發(fā)酵的前3d球擬酵母消耗阿拉伯糖的速率較慢，含量比畢赤酵母發(fā)酵同期內(nèi)阿拉伯糖的含量多，發(fā)酵3d后球擬酵母對阿拉伯糖的利用速率明顯加快，這是由于發(fā)酵液中的木糖在發(fā)酵3d后已基本沒有剩余，阿拉伯糖是發(fā)酵后期唯一可以利用的豐富碳源。

酵母菌篩選實驗表明，球擬酵母在發(fā)酵時對木糖的選擇性利用效果較好。發(fā)酵3d之后阿拉伯糖的濃度由6.67mg/m L降至5.56mg/m L，保留率為83.4%，木糖則由10mg/m L降至0.58mg/m L，保留率僅為5.8%。

圖3 酵母菌發(fā)酵液阿拉伯糖含量對比Fig.3 Comparation of L－arabinose contentin yeast fermentation broth

2.2.2 霉菌篩選結(jié)果 實驗結(jié)果表明，7種霉菌在發(fā)酵2d之后基本能將葡萄糖完全利用，其消耗木糖情況見圖4，消耗L－阿拉伯糖見圖5。

圖4 霉菌發(fā)酵液木糖含量對比Fig.4 Comparation of xylose content inmold fermentation broth

由圖4可知，7種霉菌均可利用木糖，綠木霉和鐮刀霉發(fā)酵3d后，灰霉和黑曲霉發(fā)酵4d后，交鏈孢霉發(fā)酵5d后，青霉發(fā)酵6d后木糖基本被完全消耗，而腐霉消耗木糖的速率相對較慢。

圖5 霉菌發(fā)酵液阿拉伯糖含量對比Fig.5 Comparation of L－arabinose content in mold fermentation broth

由圖4、圖5可知，綠木霉發(fā)酵3d之后木糖濃度由10mg/m L降至0.2mg/m L，保留率為2%，阿拉伯糖的濃度由6.67mg/m L降至4.67mg/m L，保留率為70%。灰霉發(fā)酵3d后阿拉伯糖的濃度由6.67mg/m L降至5.12mg/mL，保留率為76.8%，木糖則由10mg/m L降至0.52mg/m L，保留率為5.2%。

2.3 菌種篩選結(jié)果

根據(jù)一般菌種篩選材料的選取范圍，選取植被土壤、樹皮和嫩葉進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)從銀杏葉中分離純化的兩株霉菌可以在木糖培養(yǎng)基平板上生長，且生長狀態(tài)良好，原因可能是植物嫩葉部分生長旺盛，新陳代謝速度快，從而更易分離出快速分解木糖的菌株。

由銀杏葉中分離純化出的兩株霉菌，活化后接入模擬培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔24h取樣，測定結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 Mgb1對培養(yǎng)基中各單糖利用情況Fig.6 Utilization ofmonosaccharides inmedium by Mgb1

圖7 Mgb2對培養(yǎng)基中各單糖利用情況Fig.7 Utilization ofmonosaccharides inmedium by Mgb2

由圖6、圖7可知，分離純化出的的兩株霉菌對木糖和L－阿拉伯糖的選擇利用性較好。在發(fā)酵3d之后葡萄糖被完全消耗掉，Mgb1發(fā)酵液中木糖濃度由10mg/m L降至0.45mg/m L，保留率4.5%，阿拉伯糖的濃度由6.67mg/m L降至5.91mg/m L，保留率為88.6%。Mgb2發(fā)酵液中木糖濃度由10mg/m L降至0.39mg/m L，保留率為 3.9%，阿拉伯糖的濃度由6.67mg/m L降至5.18mg/m L，保留率為77.7%。

2.4 玉米皮水解發(fā)酵

按照1.2.4的方法，將球擬酵母、綠木霉、灰霉、Mgb1和Mgb2分別接入至玉米皮水解液培養(yǎng)基中發(fā)酵。結(jié)果見表1。

由表1可知，球擬酵母在發(fā)酵4d后，綠木霉、灰霉、Mgb1和Mgb2在發(fā)酵3d以后木糖的保留率均小于5%，而L－阿拉伯糖的保留率可達(dá)75%以上。與在模擬培養(yǎng)基中相比，球擬酵母的發(fā)酵周期略有延長，原因是玉米皮水解液中會產(chǎn)生乙酸、糠醛等毒性物質(zhì)抑制菌體生長［8］。

3 結(jié)論

目前工業(yè)上生產(chǎn)L－阿拉伯糖大多使用酸解半纖維素的方法，產(chǎn)物為多種單糖混合物。本實驗針對目前樹脂或薄層色譜板分離L－阿拉伯糖操作復(fù)雜且收效小的缺點，利用單糖能夠作為微生物生長碳源的生理特點分離L－阿拉伯糖。通過對常見的5種酵母菌，7種霉菌和兩株自環(huán)境中分離篩選的霉菌進(jìn)行玉米皮水解液的發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)球擬酵母發(fā)酵4d，綠木霉、灰霉和自環(huán)境中分離篩選出的霉菌Mgb1、Mgb2發(fā)酵3d后，玉米皮水解液中木糖的保留率均小于5%，L－阿拉伯糖的保留率可達(dá)75%以上，霉菌的發(fā)酵時間短于酵母菌。

研究選出了球擬酵母、綠木霉、灰霉這3種常見的微生物，對木糖和L－阿拉伯糖具有較好的選擇性利用，為今后L－阿拉伯糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，為其并提供了一種自然環(huán)境中篩選菌株的方法。

表1 5種菌株發(fā)酵玉米皮水解液結(jié)果Table 1 Results of fermentation by five strains in hydrolyzate

［1］秦海敏，俞宗沅，容如濱.L－阿拉伯糖研究進(jìn)展［J］.化工與生物工程，2006，23(2):50－52.

［2］Serik，Sanaik，Matsuon，etal.L－arabinose selectively inhibits intestinal sucrose in an uncompetitive manner and suppresses glycemic response after sucrose ingestion in animals［J］. Metabolism，1996，45(11):1368－1374.

［3］Hizukuri s.Nutritional and physiological functions and uses of L－Arabinose［J］.JAppl Glycosci，1999，46:159－165.

［4］尤新.玉米深加工技術(shù)［M］.第2版.北京:中國輕工業(yè)出版社，2008:242－243.

［5］方永亮，鄭珩，余江河.功能性甜味劑L－阿拉伯糖的研究進(jìn)展［J］.氨基酸和生物資源，2009，31(1):8－12.

［6］唐曉丹，張偉，林炳昌.L－阿拉伯糖的制備及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(10):4643－4644，4646

［7］李道義，閆巧娟，江正強，等.酵母菌發(fā)酵玉米皮酸水解制備結(jié)晶 L－阿拉伯糖的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(4): 125－128.

［8］Pessoa a，Mancilha i，Sato S.Cultivation of Candida tropicalis in sugar cane hemicellulosic hydrolysate for microbial protein production［J］.Journal of Biotechnology，1996，51:83－88.

Study on separation performance of L－arabinose in corn husk hydrolyzate by m icroorganism

ZOU Hong－fei1，2，+，ZHANG Ze－sheng1，2，+，*，ZHENG M in1，2
(1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China; 2.Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

This artic le selec ted the strains that had faster utilization of g lucose and xylose that was unab le to consum e L－arabinose，comparing the separation performance of L－arabinose in corn husk hyd rolyzate by several strains of yeast and m ould.Using five strains of yeast，seven strains ofmould and mould Mgb1，Mgb2 isolated from enviroment to ferment corn husk hyd rolyzate.The results showed that afer four-day fermentation ofTorulopsis，and three-day fermentation ofTrichoderma，Botrytiscinereaand mold Mgb1，Mgb2，the ratio of retention of xylose was less than 5%，and arabinose wasmore than 75%in corn husk hyd rolyzate.It’s separation method thatwas simp le and effective，three strains were used in common and easy to yield，p roviding some extent reference for separetion performance of L－arabinose by m ic roorganism.

corn hust hyd rolyzate;L－Arab inose;Torulopsis;Trichoderma;Botrytiscinerea

TS210.1

A

1002－0306(2012)12－0214－04

2011－09－19 *通訊聯(lián)系人 +并列第一作者

鄒鴻菲(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品營養(yǎng)。張澤生(1956－)，男，博士，教授，研究方向:營養(yǎng)與功能性食品、天然產(chǎn)物。