DNA指紋圖譜技術在中藥研究中的應用進展

張曉峰，劉福艷

(1.山東大學管理學院，山東濟南250100;2.山東省食品藥品檢驗所，山東 濟南250101)

1985年，英國科學家杰佛雷斯(Jeffreys)利用人類微小衛星區的DNA進行了生物個體與種屬的鑒別，并首次把這一技術稱之為DNA指紋(DNA fingerprinting)圖譜技術［1］。眾所周知，絕大多數的中藥材都是植物體、動物體和菌物體，而一切生命體都可以從基因水平或者說DNA水平上進行刻劃，因此，DNA分子水平上的指紋最能從本質上表征中藥材自身特征。DNA指紋圖譜技術是一種在分子水平上、以藥材基因型特征為鑒定指標的新技術，它直接分析遺傳物質DNA本身，是分析生物的基因型而非表現型，排除了環境因素給藥材鑒定帶來的干擾，也不受樣品形態(藥材原植物、飲片或粉末)和材料來源的影響，比傳統的方法(性狀、顯微、理化鑒定)更準確可靠，它不僅能區分相近物種(同科、同屬不同種)，而且可以檢測外形極為相似的同種不同變種、變型、品系、化學型乃至個體之間的DNA的細微變異。這一技術近年來正越來越廣泛地被應用于中藥研究中［2］。本文結合有關文獻，綜述了DNA指紋圖譜的概念、原理、發展歷程及近年來在中藥質量研究領域的應用進展情況，為相關研究提供參考。

1 DNA指紋圖譜的概念與原理

DNA指紋圖譜技術是將個體的染色體DNA用限制性內切酶消化，分離得到不同大小的DNA片段，再以重復序列中的共有序列作為核酸探針進行雜交，對所得到不同生物個體相似DNA片段的帶型圖譜(即DNA指紋圖譜，對每一個體都是獨特的)進行分析的方法。該技術能揭示并比較生物個體間關系的密切程度，有效地應用于遺傳分析、種質鑒定等方面。不同種生物體含有不同的DNA序列，同種生物體既有相同的DNA序列，保持同種生物體的遺傳性狀，又具有多態性，這種多態性可以是個體、種屬或變異等引起的，它使得同種生物中的各個體千差萬別，生物多樣性正是由于其基因多態性的結果。在分子水平上檢測基因多態性，比形態、組織和化學水平上檢測更能代表其變異類的遺傳標記，其鑒別結果更加準確可靠。DNA指紋技術靈敏度高，如果選擇合適的擴增引物，其結果的重復性也非常好［2］。

2 DNA指紋圖譜技術的發展歷程

DNA指紋研究始于二十世紀八十年代初期，是一種稱作限制性片段長度多態性(英文縮寫RFLP)［3］的標記技術。在細胞中有一種特殊的酶——限制性核酸內切酶，它可以把DNA切割成長度不同的片段。這種酶有一個特點，就是它只能在DNA的特定位點上進行切割，而且，只能識別這些特異的位點。在長期的進化過程中，不同種屬的生物體中DNA上的這些限制性核酸內切酶的切割位點是各不相同的，因此，當用一種限制性核酸內切酶對某種生物體DNA進行切割時，就會產生一系列長度不同的酶切片段，形成該種生物特異的DNA指紋圖譜，這種指紋圖譜就叫做RFLP圖譜。不同種生物的RFLP圖譜是不同的，因此，根據RFLP圖譜就可以進行中藥材的品種鑒定。RFLP技術是發展最早的DNA指紋標記技術，其缺點是實驗步驟繁瑣，費時費力，應用不便，價格昂貴。

1985年，美國科學家穆里斯(Mullis)發明了一種稱之為聚合酶鏈式反應(PCR)的技術［4～6］。這種技術是先人工合成一對幾個至十幾個核苷酸長的寡核苷酸引物，利用這對引物和DNA聚合酶，在有四種脫氧單核苷酸存在的條件下，就可以將要擴增的DNA片段進行指數倍地擴增，而這一切只在試管中就可以完成。

在PCR技術的基礎上，1990年，威利姆斯(Williams)發明了另一種新的DNA指紋圖譜技術——隨機擴增多態性DNA(英文縮寫RAPD)技術［7］。與PCR技術中合成一對引物不同的是，在RAPD技術中，是合成一系列9－10個核苷酸長的核苷酸排列順序隨機的單鏈引物，然后，用這些引物對基因組DNA進行PCR擴增。由于不同種屬生物可擴增出的DNA片段與長度的不同，就可以形成代表這種生物自身特征的指紋圖譜，從而可以進行生物物種的鑒定。因此，RAPD技術廣泛用于中藥DNA指紋圖譜的構建，在目前絕大多數藥用動植物DNA序列還未知的情況下，RAPD技術具有廣闊的應用前景。PCR技術的誕生使目的基因極易獲得，再與RFLP聯用，還產生了PCR－RFLP、RAPD－RFLP等方法。

20世紀90年代荷蘭科學家Pieter Vos［8］等發明、發展了高效檢測DNA多態性的新方法，稱為擴增片段長度多態性DNA(Ampli－ fied Fragment Length Polymorphism，AFLP)。AFLP是基于PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。它結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由于AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增后得到的DNA多態性可做為一種分子標記，與RFLP、RAPD比較，AFLP法構建的DNA指紋圖譜在操作前不需要提供序列信息，而且具有效率高、重復性好、靈敏度高的優點，其所檢測到的大多數擴增片斷與基因組的單一位置對應，顯示了AFLP技術特別適合中藥品種鑒定的應用價值和廣闊前景。

SSR(Simple Sequence Repeats)標記技術是近年來發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術，也稱為微衛星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列。在真核生物中，存在許多2～5 bp簡單重復序列，稱為“微衛星DNA”，其兩端的序列高度保守，可設計雙引物進行PCR擴增，揭示其多態性。SSR具有以下一些優點:①一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點;②微衛星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子;③所需DNA量少。

ISSR(inter－ simple sequence repeat)是 Zietkeiwitcz［9］等于1994年發展起來的又一種微衛星基礎上的分子標記。ISSR引物的開發不像SSR引物那樣需測序獲得SSR兩側的單拷貝序列，開發費用降低。與SSR標記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標記一樣具有較強的種特異性;與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測非常方便，因而是一種非常有發展前途的分子標記。目前，ISSR標記已廣泛應用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進化及分子生態學研究中。

3 DNA指紋圖譜在中藥研究中的應用

近年來，中醫藥工作者將DNA指紋圖譜技術引入到自己的研究領域，并取得了令人矚目的成果，對中醫藥學的現代化進程產生了積極的推動作用。

3.1 名貴中藥材鑒定、道地性研究 中藥材真偽鑒別及道地品種鑒定是目前DNA指紋圖譜技術在中藥研究中應用最多的一個領域。隨著摻偽技巧越來越高，有時單憑傳統的經驗鑒別方法已難以辨別真偽，常規理化鑒別又存在著用樣量大，操作復雜，專屬性不強等缺點。DNA指紋圖譜技術以其取樣量小、減少貴重樣品損消耗、鑒定結果準確、靈敏性高等特點越來越受到人們的重視，近年來成為中藥材鑒定的重要研究手段。中藥材的質量除了與藥材特定的生長環境和特殊的采收加工技術有關外，還與該藥材產區內這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關，這就是藥材的“道地性”。但以前對道地藥材“道地性”的研究僅限于化學、藥理學方面。通過DNA指紋標記技術和化學、藥理學手段結合對道地藥材進行研究，并進一步對遺傳因素和環境因素在藥用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的關系進行研究，能更好地對道地藥材、名優藥材進行品質評價。表1列舉了DNA指紋圖譜技術在中藥鑒定分析及道地性鑒別中的部分應用。

表1 DNA指紋圖譜技術中藥遺傳分析及鑒定中的部分應用實例

3.2 藥種質資源的研究和遺傳育種 藥用植物種質資源是一切可用于藥物開發的植物遺傳資源，是所有藥用植物物種資源的總和。種質資源是基因的載體，植物種內所有個體及遺傳性狀的基因構成了該物種的種質資源。對于遺傳多樣性水平較低的品種，應盡可能獲得更多的變異類型，可在自然界中尋找、收集變異植株，或通過分子生物技術手段增加其自然變異率，如體細胞克隆變異、γ或UV射線致突變、原生質體培養等方法。DNA指紋技術可用于藥材個體或群體的變異觀察。分析這些變異類型的遺傳分化程度及遺傳多樣性水平，對藥材的選種有重要意義［2］。通過DNA指紋技術分析藥材不同品種的遺傳關系及其差異性，在探明物種遺傳背景和親緣關系的基礎上，為中藥材物種資源的分析和評價及藥效學相關基因和抗病基因的定位提供重要信息，推動藥材遺傳育種的進程，同時為今后分離有價值的藥用動植物目的基因打好基礎，并為構建藥用動植物基因庫提供資料。王志安［25，26］等通過采取及栽培中藥材白術樣品，采用AFLP指紋分析技術，獲得了3 003條白術的多態性擴增條帶，建立了中藥白術種質的AFLP指紋圖譜分析體系，為我國道地藥材白術的種質保存和育種提供證據。其他如石斛［27］、絞股藍［28］、丹參［29］、纈草［30］等藥用植物都有應用 DNA 指紋圖譜對其種質資源進行分析的報道，為進一步應用DNA指紋圖譜進行資源鑒定和中藥育種學提供參考。

3.3 活性成分基因表達調控的研究 生物體內的各種功能蛋白質和酶都是相應基因編碼、表達的產物，研究中藥材活性成分基因的差異表達對其不同特性、調控機理及基因功能的研究都有重要意義。藥用植物的生長周期是基因在一定的時空中表達的結果，伴隨著相應的次生代謝化學成分的產生。DNA指紋圖譜技術對于闡明藥用植物不同生長期的分子調控機制有積極的意義，通過與cDNA等技術結合，可以達到篩選品質基因，增加有效次生代謝產物合成量，提高藥材品質的目的。

4 討論與展望

綜上所述，DNA指紋圖譜技術已經逐漸成為中藥材研究中的重要工具和手段。隨著DNA指紋技術的逐漸完善，其特異性和信息量逐漸增加，檢測的精確度越來越高，對于分子水平上鑒定中藥真偽、道地性研究、遺傳分析和育種以及有效成分的基因表達調控等方面的研究產生了劃時代的意義，具有廣闊的前景。隨著新技術的出現和各技術間的相互結合使用，DNA指紋圖譜技術將會在中藥研究中發揮更大作用。

［1］Jeffreys AJ，Wilson V，Thein SL.Hypervariable minisatellite regions in human DNA.Nature，1985，314(7):67.

［2］江峰.DNA指紋圖譜技術及其在中藥研究中的應用［J］.海峽藥學，2005，17(4):183 －185.

［3］Lander ES，Botstein D.Mapping complex genetic traits in humans:new methods using a complete RFLP linkage map［J］.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，1986，51:49 －62.

［4］Saiki RK，Scharf S.Faloona F，et al.Enzymatic amplification of beta－globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia［J］.Science，1985，230(4732):1350 －1354.

［5］Mullis K，Faloona F，Scharf S，et al.Specific enzymatic amplification of DNA in vitro:the polymerase chain reaction［J］.Cold Spring Harbr Symp in Quant Biol，1986，51(1):263－273.

［6］Mullis KB，Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase － catalyzed chain reaction［J］.Methods Enzymol，1987，155:335 －350.

［7］Williams JG，Kubelik AR，Livak KJ，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acids Res，1990，18(22):6531 －6535.

［8］Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucl Acids Res，1995，23(21):4407－4414.

［9］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)－anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics，1994，20(2):176－183.

［10］丁建彌，萬樹文，梅其春.用隨機擴增DNA(RAPD)技術鑒定野生山參［J］.中成藥，2001，23(1):3 －5.

［11］Shaw PC，But PP.Authentication of Panax species and their adulterants by random－primed polymerase chain reaction［J］.Planta Med，1995，61(5):466 －469.

［12］曹暉，畢培曦，邵鵬柱.中藥材蒲公英及其混淆品的DNA 指紋鑒別研究［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，1996，5(4):186 －194.

［13］王義權，周開亞，徐珞珊，等.中藥材烏梢蛇及其混淆品的DNA序列分析鑒別［J］.藥學學報，1999，34(1):67－71.

［14］李堅韌，王紅艷，康熙雄.RAPD技術對白花蛇舌草真偽鑒別的應用［J］.中國誤診學雜志，2009，9(3):509－510.

［15］吳平，周開亞，張朝暉，等.海馬類藥材的分子遺傳標記鑒定研究［J］.藥學學報，1998，33(3):67－74.

［16］崔光紅，陳敏，黃璐琦，等.藥用肉蓯蓉的遺傳多樣性RAPD分析［J］.中國中藥雜志，2004，29(8):727－730.

［17］邵愛娟，李欣，黃璐琦，等.不同種源黃芩的RAPD分析［J］.中國中藥雜志，2006，31(6):452 －455.

［18］羅志勇，周鋼，周肆清，等.AFLP法構建人參、西洋參基因組 DNA 指紋圖譜［J］.藥學學報，2000，35(8):626－629.

［19］陳要臻，王嵐，馬逾英，等.川芎簡單序列重復間區多態性和擴增片段長度多態性分子標記技術多態性比較研究［J］.時珍國醫國藥，2009，20(6):1422 －1424.

［20］梁洪卉，程舟，楊曉伶，等.青海省冬蟲夏草的遺傳變異及親緣關系的形態性狀和 ISSR分析［J］.中草藥，2005，36(12):1859 －1864.

［21］左云娟，朱培林，劉強，等.道地藥材江枳殼品種遺傳學關系的ISSR證據［J］.中國中藥雜志，2005，30(18):1416－1419.

［22］沈穎，徐程，萬小鳳.ISSR－PCR在石斛種間鑒別中的應用［J］.中草藥，2005，36(3):423 －427.

［23］徐紅，王燕燕，魏丹紅，等.不同產地丹參藥材的ISSR分析與鑒別［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(6):454－457.

［24］王潤玲，唐鋮，周曄，等.玉竹及其摻偽品的RAPD鑒定［J］.中草藥，2006，37(11):1727 －1729.

［25］王志安，徐行，沈曉霞，等.白術種質AFLP指紋圖譜分析體系的建立和應用［J］.中藥材，2008，31(4):483－487.

［26］肖碩.AFLP分子標記技術在中藥研究中的應用進展［J］.生物技術通報，2010，5(12):69 －72.

［27］虞泓，和銳，倪念春，等.石斛屬4種植物的AFLP分析［J］.中草藥，2004，35(7):808 －810.

［28］江波.縉云山藥用植物絞股藍遺傳多樣性研究［D］.重慶:西南師范大學，2005.

［29］郝崗平，孫立彥，史仁玖，等.山東產丹參遺傳多樣性的擴增片段長度多態性指紋分析［J］.時珍國醫國藥，2007，18(1):51 －53.

［30］黃寶康.中國纈草屬植物的生藥學及纈草的種內變異研究［D］.上海:第二軍醫大學，2005.