蛋氨酸羥基類似物對肉雞腸道氧化還原狀態(tài)的影響

于 瑋，趙瑞英，趙 琰，唐元元，施用暉，2，樂國偉，2，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院食品營養(yǎng)與功能因子研究中心，江蘇無錫 214122;

2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122)

蛋氨酸羥基類似物對肉雞腸道氧化還原狀態(tài)的影響

于 瑋1，趙瑞英1，趙 琰1，唐元元1，施用暉1，2，樂國偉1，2，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院食品營養(yǎng)與功能因子研究中心，江蘇無錫 214122;

2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122)

目的:研究蛋氨酸(DLM)、蛋氨酸羥基類似物(HMTBA)及其鈣鹽(HMTBA－Ca)對肉雞腸道氧化還原狀態(tài)的影響。方法:1日齡羅斯肉雞(44g)隨機分為對照組(基礎(chǔ)日糧)和實驗組(在基礎(chǔ)日糧中分別添加0.1%和0.2%的DLM、HMTBA及HMTBA－Ca)，共7個處理組。結(jié)果:與對照組相比，0.1%HMTBA組和0.1%HMTBA－Ca組可顯著降低全血ROS水平，提高腸道GSH/GSSG和T－AOC，降低血漿及組織MDA含量。0.2%HMTBA組和0.2%HMTBA－Ca組可顯著提高血漿和組織CAT活性。基礎(chǔ)日糧中添加HMTBA和HMTBA－Ca均可使腸絨毛高度升高、隱窩深度下降、V/C升高。此外，0.1%HMTBA組和0.1%HMTBA－Ca組ROS水平及MDA含量均低于0.1%DLM組，腸絨毛高度和V/C則高于0.1%DLM組。結(jié)論:與DLM相比，HMTBA及HMTBA－Ca能更好地提高腸道抗氧化能力，降低ROS水平，維持腸道氧化還原穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)腸道健康發(fā)育。

蛋氨酸，蛋氨酸羥基類似物，氧化還原狀態(tài)，腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

家禽體溫高，代謝強度大，是研究機體氧化還原狀態(tài)的理想模型。腸道是動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，也是自由基(ROS)產(chǎn)生的主要場所。過量ROS誘發(fā)氧化應(yīng)激，極易損傷腸道粘膜等，導(dǎo)致消化吸收功能異常和腸源性感染，影響腸道粘膜細(xì)胞的增殖與分化［1］。因此，維護(hù)腸道氧化還原穩(wěn)態(tài)對維持生長發(fā)育與健康具有重要意義。蛋氨酸是機體必需氨基酸之一，在體內(nèi)發(fā)揮重要生理功能［2－3］。目前，常用蛋氨酸源包括DL－蛋氨酸(DLM)、蛋氨酸羥基類似物(HMTBA)及其鈣鹽(HMTBA－Ca)。日糧中添加DLM過量極易引起脂質(zhì)過氧化損傷［4］和血管內(nèi)膜損傷［5］等毒性作用，而添加過量等摩爾DLM和HMTBA，HMTBA組血漿中同型半胱氨酸(Hcy)水平顯著低于DLM組［6］，Hcy可引起肝臟氧化應(yīng)激、抗氧化能力下降［7］，推測DLM的毒性可能與氧化損傷有關(guān)。HMTBA是蛋氨酸α－碳上氨基被羥基取代的產(chǎn)物，與DLM相比，HMTBA可緩解動物熱應(yīng)激［8］、減少氮排泄［9］和清除自由基［10］等作用。HMTBA作為一種蛋氨酸源具有抗氧化活性高和毒性低的特點。目前，對HMTBA的研究主要集中在生物學(xué)相對效價和體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化，而有關(guān)HMTBA及其鈣鹽調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的研究，國內(nèi)未見相關(guān)報道。因此，本實驗以羅斯肉雞作為研究對象，通過日糧中添加不同劑量蛋氨酸源(DLM，HMTBA和HMTBA－Ca)，研究其對肉雞腸道氧化還原狀態(tài)及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步研究氧化還原狀態(tài)對腸道功能的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1日齡健康雄性羅斯肉雞(體重約44g) 江蘇無錫祖代雞場有限公司;DL－蛋氨酸(DLM，純度98%)、蛋氨酸羥基類似物(HMTBA，純度88%)、蛋氨酸羥基類似物鈣鹽(HMTBA－Ca，純度84%)

ADISEEO公司。

5430R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司; MPI－B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光檢測儀 西安瑞邁分析儀器公司;F96熒光分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;WH－3微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司;DK－600型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Mk3酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組與飼養(yǎng) 1日齡雄性羅斯肉雞105只，隨機分為:對照組和實驗組(0.1%DLM組、0.2%DLM組、0.1%HMTBA組、0.2%HMTBA組、0.1%HMTBA－Ca組及0.2%HMTBA－Ca組)。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，實驗組飼喂基礎(chǔ)日糧分別添加0.1%DLM、0.2%DLM、0.1%HMTBA、0.2%HMTBA、0.1%HMTBA－Ca、0.2%HMTBA－Ca。每組3個重復(fù)(籠)，每個重復(fù)5只雞。

肉雞基礎(chǔ)日糧參照《家禽營養(yǎng)需要》(NRC，1994)，基礎(chǔ)日糧組成見表1。前期和飼料均制成顆粒。

實驗期46d，采用籠養(yǎng)，24h光照，自由采食與飲水。1～21日齡飼喂前期顆粒料，22～46日齡飼喂中期顆粒料。按常規(guī)方法進(jìn)行免疫接種。

1.2.2 樣品制備 在實驗的第46d采集樣品(每個重復(fù)取2～3只，每組共取8只)。肉雞稱重后斷頸取血處死，全血肝素鈉抗凝立即測自由基(ROS)，其余離心(4000r/min，10min)制備血漿。取肝臟、十二指腸、空腸、回腸和盲腸腸段，用預(yù)冷生理鹽水按1∶10 (W/V)制備組織勻漿液，測定氧化還原指標(biāo)。分別剪下十二指腸(離胃幽門3cm處)和空腸中段組織約1cm，置于4%甲醛溶液固定。

表1 基礎(chǔ)日糧組成(%)Table 1 Compositions of basal diet(%)

1.2.3 自由基檢測 參照luminol化學(xué)發(fā)光法測定全血中自由基(ROS)水平。取新鮮抗凝血25μL稀釋于855μL Hepes(pH7.4)緩沖液中，加入20μL HRP (12.4U/mL)作為催化劑，將反應(yīng)體系混勻，使用MPI－B型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測，啟動發(fā)光后注射100μL luminol(5mmol/mL)于整個反應(yīng)體系中［10］。以發(fā)光強度表示ROS水平的高低。

1.2.4 氧化還原指標(biāo)的測定 血漿和組織的氧化還原指標(biāo):還原型與氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/ GSSG)、過氧化氫酶 (CAT)、總抗氧化能力(T－AOC)、和丙二醛(MDA)，采用試劑盒測定，并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 石蠟切片的制作與觀察 4%甲醛溶液固定的腸道組織依次經(jīng)脫水→透明→浸蠟→包埋→修塊→切片→展開→貼片等處理，蘇木精－伊紅染色制成組織切片［11］，顯微鏡觀察并測量各腸段的絨毛高度(V)及相應(yīng)的隱窩深度(C)，并計算V/C。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和肝臟自由基(ROS)的影響

由表2顯示，基礎(chǔ)日糧中添加0.1%HMTBA和0.1%HMTBA－Ca可顯著降低全血 ROS水平(p＜0.05)。而0.1%DLM組和0.2%DLM組ROS水平與對照組相比無顯著性差異。表明HMTBA和HMTBA－Ca體內(nèi)抗氧化活性明顯優(yōu)于DLM。

表2 不同蛋氨酸源對肉雞全血自由基水平的影響(全血:cd/μL)Table 2 Effects of methionine sources on ROS contents of blood of broiler chickens(blood:cd/μL)

表3 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和組織GSH/GSSG的影響(比值)Table 3 Effects of methionine sources on GSH/GSSG of plasma and tissues of broiler chickens(ratio)

表4 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和組織CAT的影響(血漿:U/mL;組織:U/mg prot)Table 4 Effects of methionine sources on CAT contents of plasma and tissues of broiler chickens(plasma:U/mL;tissues:U/mg prot)

表5 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和組織T－AOC的影響(血漿:U/mL;組織:U/mg prot)Table 5 Effects of methionine sources on T－AOC contents of plasma and tissues of broiler chickens(plasma:U/mL;tissues:U/mg prot)

2.2 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和組織GSH/GSSG的影響

谷胱甘肽是體內(nèi)重要的小分子活性寡肽，包括還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，在生物體內(nèi)防御體系中起重要作用［12］。GSH能夠清除自由基而自身轉(zhuǎn)化為GSSG［13］。機體在正常狀態(tài)下，GSH/GSSG處于穩(wěn)定狀態(tài);當(dāng)機體受到氧化協(xié)迫時，產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致GSH減少，GSSG含量提高［14］。因此GSH/GSSG是反映氧化還原狀態(tài)的重要指標(biāo)。由表3可知，在基礎(chǔ)日糧中添加3種蛋氨酸源均可不同程度提高血漿和組織GSH/GSSG。其中HMTBA組的血漿、肝臟、空腸、回腸、盲腸以及HMTBA－Ca組的血漿、十二指腸、肝臟、回腸、盲腸的GSH/GSSG比值高于DLM組。

2.3 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和組織CAT的影響

CAT可清除過氧化體系中的H2O2，是衡量ROS生成量的重要指標(biāo)［15］。與對照組相比，表4顯示，0.2%HMTBA組和0.2%HMTBA－Ca組血漿、肝臟、盲腸CAT活性顯著提高(p＜0.05)，0.2%HMTBA－Ca組回腸活性顯著提高(p＜0.05)。且0.2%HMTBA和0.2%HMTBA－Ca組CAT活性高于0.1%HMTBA和0.1%HMTBA－Ca組。與之相反，0.1%DLM組十二指腸、空腸的CAT活性顯著降低(p＜0.05)。

2.4 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和組織T-AOC的影響

T－AOC反映機體防御體系總抗氧化能力的強弱，與健康程度存在著密切聯(lián)系。由表5可知，3種蛋氨酸源均可顯著提高肉雞回腸、盲腸T－AOC水平(p＜0.05)。與對照組相比，0.1%HMTBA組、0.2% HMTBA組和0.1%HMTBA－Ca組可顯著提高回腸、盲腸的T－AOC水平(p＜0.05)。0.1%HMTBA組的十二指腸、空腸和0.2%HMTBA組的血漿、肝臟以及0.1%HMTBA－Ca組的空腸、0.2%HMTBA－Ca組的盲腸與對照組相比T－AOC水平顯著提高(p＜0.05)。而DLM組的血漿、肝臟、空腸與對照組相比則無顯著性差異。

2.5 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和組織MDA的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的活性羥基類物質(zhì)，具有細(xì)胞毒性，其含量高低反映機體脂質(zhì)過氧化水平和細(xì)胞損傷的程度。如表6所示，與對照組相比，各實驗組肝臟和盲腸MDA含量均顯著降低(p＜0.05)。除此之外，與對照組相比，0.1%HMTBA組的空腸及回腸的 MDA含量均顯著降低(p＜0.05)，0.1%HMTBA－Ca組中除血漿、空腸外其他組織的MDA含量均顯著降低(p＜0.05)，0.2%HMTBA組和0.2%HMTBA－Ca組中除血漿外其余組織的MDA含量均顯著降低(p＜0.05)。與DLM組相比，HMTBA組及HMTBA－Ca組能夠更顯著地降低組織的MDA含量。

表6 不同蛋氨酸源對肉雞血漿和組織MDA的影響(血漿:nmol/mL;組織:nmol/mg prot)Table 6 Effects of methionine sources on MDA contents of plasma and tissues of broiler chickens(plasma:nmol/mL;tissues:nmol/mg prot)

表7 不同蛋氨酸源對肉雞腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(絨毛高度:μm;隱窩深度:μm)Table 7 Effects of methionine sources on intestinal villus height and recess depth of broiler chickens(villus height:μm;recess depth:μm)

2.6 不同蛋氨酸源對肉雞腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表7可知，與對照組相比，各實驗組的十二指腸及空腸絨毛高度均有一定程度提高。除0.2%DLM組和0.2%HMTBA組外，其余各組十二指腸絨毛高度均顯著提高(p＜0.05)。各實驗組隱窩深度顯著降低，以0.1%HMTBA－Ca組差異最為顯著(p＜0.05)。此外，基礎(chǔ)日糧中添加0.1%HMTBA－Ca可顯著提高V/C比值，表明HMTBA－Ca可調(diào)節(jié)十二指腸和空腸發(fā)育。

3 討論

腸道是機體營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，物質(zhì)代謝和能量代謝極其旺盛，分泌腺體與粘膜細(xì)胞極易受氧化應(yīng)激損傷，腸道結(jié)構(gòu)與功能的完整性與氧化還原穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)［16］。高溫、高能膳食等環(huán)境和營養(yǎng)因素極易引發(fā)氧化應(yīng)激。當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，ROS可直接造成腸道脂質(zhì)過氧化損傷、蛋白質(zhì)變性以及酶失活，進(jìn)而導(dǎo)致腸粘膜損傷、粘液層變薄、絨毛變短、絨毛表面積減少等生理破壞，嚴(yán)重影響腸道吸收消化功能［1，17－18］。因此，維護(hù)腸道氧化還原穩(wěn)態(tài)對動物生長發(fā)育具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，高脂膳食引發(fā)腸道氧化還原狀態(tài)失衡，硫辛酸通過直接清除自由基以及提高抗氧化通路相關(guān)功能基因的表達(dá)水平解除氧化應(yīng)激，防止由高脂膳食引發(fā)的腸道功能損傷［19］。日糧中添加適量抗氧化劑(如VC、VE、硫辛酸、鐵硒鋅、半胱胺等)可提高腸道抗氧化能力，維護(hù)氧化還原健康穩(wěn)態(tài)［1，16］。

HMTBA及其鈣鹽是一種廉價且可靠的蛋氨酸源。研究發(fā)現(xiàn)，HMTBA與DLM的結(jié)構(gòu)差異使其發(fā)揮不同生理作用。由于HMTBA及其鈣鹽本身不含有氨基，因而在代謝中不會發(fā)生脫氨基作用，在體內(nèi)代謝形成蛋氨酸的過程中可有效利用血液游離氨，增加氮沉積，減少氮排泄［9］。與DLM相比，HMTBA轉(zhuǎn)化成尿酸時產(chǎn)生較少的余熱，可有效緩解熱應(yīng)激［8］。楊永蘭等［10］報道，高脂日糧中添加一定劑量的HMTBA可顯著降低小鼠血液和肝臟ROS和MDA水平，提高T－AOC和CAT活性。可見，HMTBA不僅是一種蛋氨酸源同時還具有抗氧化活性。蛋氨酸是禽類第一限制性氨基酸，本實驗以羅斯肉雞作為研究對象，通過在基礎(chǔ)日糧中添加不同劑量蛋氨酸源，探討其對腸道氧化還原狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示，HMTBA及其鈣鹽可顯著降低肉雞全血的ROS水平，提高血漿及腸道GSH/GSSG、CAT活性、T－AOC能力，顯著降低血漿及腸道MDA水平，且效果優(yōu)于DLM。表明HMTBA及其鈣鹽維持腸道氧化還原穩(wěn)態(tài)與其抗氧化活性有關(guān)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，體外HMTBA對·OH以及DPPH·的清除能力和肝臟脂質(zhì)過氧化抑制率顯著高于DLM。等摩爾DLM和HMTBA飼喂北京鴨，DLM組的血漿同型半胱氨酸(Hcy)含量顯著高于HMTBA組［6］，可引起肝臟氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化物含量升高［7］。Martin－Venegas等［20］報道，HMTBA在腸道比DLM能更有效地生成半胱氨酸(Cys)和牛磺酸(Tau)，前者作為谷胱甘肽的前體在腸道上皮細(xì)胞的抗氧化功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，牛磺酸具有解毒、抗氧化等多種生理功能。此外，與DLM在腸道的主動吸收［21］不同，HMTBA主要通過被動擴散［22］進(jìn)入機體，并經(jīng)由代謝轉(zhuǎn)換為蛋氨酸發(fā)揮生物學(xué)功能。主動轉(zhuǎn)運需要消耗ATP易產(chǎn)生大量ROS，而被動擴散不消耗ATP產(chǎn)生的ROS較少。可見，HMTBA及其鈣鹽在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，其可能是通過直接或代謝轉(zhuǎn)換清除ROS的。

腸道絨毛高度與細(xì)胞數(shù)呈顯著相關(guān)，只有成熟細(xì)胞才具有吸收養(yǎng)分的功能，絨毛越長，成熟細(xì)胞多，養(yǎng)分吸收能力好;隱窩深度反映細(xì)胞生成率，隱窩變淺，表明細(xì)胞成熟率上升，分泌功能增強［23］。絨毛高度/隱窩深度則綜合反映腸道功能狀態(tài)，比值下降，表明粘膜受損消化率下降;比值上升，則粘膜改善，吸收功能增強，生長加快［23］。本研究發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)日糧中添加HMTBA和HMTBA－Ca可顯著提高十二指腸、空腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，降低相應(yīng)的隱窩深度。表明蛋氨酸羥基類似物及鈣鹽可促進(jìn)腸細(xì)胞發(fā)育，改善小腸功能狀態(tài)，降低腸粘膜受損程度，這可能與HMTBA的抗氧化能力有關(guān)。

綜上，蛋氨酸羥基類似物及鈣鹽能提高腸道抗氧化能力，降低ROS水平，維持腸道氧化還原穩(wěn)態(tài)，并且有利于腸道細(xì)胞發(fā)育，具體的作用機制還有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of 2－h(huán)ydroxy－4－(methylthio)butanoic acid on intestinal redox state of broiler chickens

YU Wei1，ZHAO Rui－ying1，ZHAO Yan1，TANG Yuan－yuan1，SHI Yong－h(huán)ui1，2，LE Guo－wei1，2，*
(1.School of Food Science and Technology，The Research Center of Food Nutrition and Functional Factors，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;
2.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Objective:To research the effects of methionine sources methionine(DLM)，2－h(huán)ydroxy－4－(methylthio) butanoic acid(HMTBA)and 2－h(huán)ydroxy－4－(methylthio)butyrate calcium(HMTBA－Ca)on intestinal redox state of broiler chickens.Method:One hundred and five(105)broiler chickens(44g)were randomly divided into 7 groups (15 birds per group)，and each group was assigned to 1 of 3 treatments.Birds in each group were kept in three coops(5 broilers per coop).All broilers were offered the same basal diet with added DLM，HMTBA and HMTBACa at levels of 0(control group)，0.1%and 0.2%.Results:Compared with control group，basal diet with 0.1% HMTBA group and 0.1%HMTBA－Ca group could decrease the level of free radicals in whole blood significantly，enhance the activity of GSH/GSSG，T－AOC of the serum and tissues significantly，decrease the level of MDA significantly.Compared with control group，basal diet with 0.2%HMTBA group and 0.2%HMTBA－Ca group could enhance the activity of CAT of the serum and tissues significantly.Basal diet with added HMTBA，HMTBA－Ca could enhance the intestinal villus height(V)and the ratio of the villus height to recess depth of broilers(V/C)，decrease the intestinal recess depth(C)of broilers significantly.Compared with 0.1%DLM group，ROS，MDA levels were lower and V，V/C were higher in basal diet with 0.1%HMTBA group and 0.1%HMTBA－Ca group.Conclusion: Compared with DLM，HMTBA and HMTBA－Ca could better increase the intestinal antioxidative capacity，decrease the level of free radicals，steady intestinal redox state，promote the intestinal development healthily.

methionine;2－h(huán)ydroxy－4－(methylthio)butanoic acid;redox state;intestinal morphology

TS201.6

A

1002－0306(2012)21－0099－05

2012－04－25 *通訊聯(lián)系人

于瑋(1987－)，女，碩士研究生，主要從事營養(yǎng)代謝與調(diào)控方面的研究。

十二五國家科技支撐計劃(2012BAD33B05)。