柱前DPPH- HPLC-DAD-MS聯(lián)用快速鑒定紫薯中的抗氧化花色苷

傅茂潤，何志平，趙 雙，劉玉芹，劉秀河，王 曉

(1.山東輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，山東濟南250353;2.浙江農(nóng)林大學食品學院，浙江臨安311300; 3.山東阿如拉醫(yī)藥發(fā)展有限公司，山東濟南250100;4.山東省科學院山東省分析測試中心，山東濟南 250001)

柱前DPPH- HPLC-DAD-MS聯(lián)用快速鑒定紫薯中的抗氧化花色苷

傅茂潤1，何志平2，趙 雙1，劉玉芹3，劉秀河1，王 曉4，*

(1.山東輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，山東濟南250353;2.浙江農(nóng)林大學食品學院，浙江臨安311300; 3.山東阿如拉醫(yī)藥發(fā)展有限公司，山東濟南250100;4.山東省科學院山東省分析測試中心，山東濟南 250001)

為建立一種能夠快速、準確的鑒別并比較具有抗氧化活性的花色苷的方法，以紫薯為研究對象，采用DPPH自由基柱前衍生化與HPLC聯(lián)用技術(shù)分析具有抗氧化活性的花色苷物質(zhì)特征峰，然后采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定，從紫薯中鑒定出6種花色苷，由于結(jié)構(gòu)的不同，6種花色苷的抗氧化活性有較大的差異，其中飛燕草－3，5－雙葡萄糖苷的抗氧化能力最強，其它的相對較弱。該方法的建立，有助于實現(xiàn)花色苷類物質(zhì)抗氧化活性的快速比較和鑒定，揭示其構(gòu)效關(guān)系提供理論和技術(shù)支持。

抗氧化活性，花色苷，柱前衍生化反應(yīng)，紫薯

花色苷具有很強的抗氧化能力［1］，可有效清除脂類自由基，切斷脂類氧化的鏈式反應(yīng)，起到防止脂質(zhì)過氧化的作用［2］，因此，對顏色較深果蔬及花卉的抗氧化活性及作用機制研究已成為近年來的熱點，如藍莓、黑豆、紫甘薯、楊梅、桑椹等［3－7］。目前學者們對花色苷的分析手段大多停留在總花色苷的提取與測定階段，對起抗氧化作用的具體花色苷單體及它們的活性差異尚無法準確分析和比較，這已成為花色苷研究中的一個難點。在花色苷活性物質(zhì)分離、純化和鑒定過程中，一般都遵循植物化學研究的模式，即首先應(yīng)用各種分離手段對化學成分進行系統(tǒng)分離與結(jié)構(gòu)鑒定，再對得到的單體成分進行活性測試［8］。應(yīng)用這種方法，很多食品活性成分得以闡明，但仍存在一些問題，包括目標不明確、操作繁瑣、工作量大、周期長、活性成分在分離過程中易丟失;自身結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，花色苷在分離和純化過程中經(jīng)常會變化或分解，導(dǎo)致含量減少或性質(zhì)改變;食品及其制品是個復(fù)雜的體系，種類及種間的酸性、糖度、維生素、蛋白質(zhì)、脂肪、物性等個體差異很大，環(huán)境、成熟度、采后加工方式等影響因素較多。以上的原因都會造成抗氧化活性的差異，也為抗氧化活性花色苷的定性和定量帶來了很大困難，只有搞清楚食品中天然的花色苷，才有可能對其降解機制和活性進行有效、準確的研究。因此很有必要建立一種能夠快速、準確的分析鑒別具有抗氧化活性的花色苷的方法。本文以紫薯為研究對象，采用自由基柱前衍生化反應(yīng)與HPLC聯(lián)用技術(shù)分析具有抗氧化活性的花色苷物質(zhì)特征峰，然后采用質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，從而建立一種有別于傳統(tǒng)分離－純化－鑒定有效物質(zhì)的快速、簡單的新方法。該方法的建立，有助于實現(xiàn)花色苷物質(zhì)的快速鑒定，從而為探知食品和花卉中天然的花色苷物質(zhì)，揭示其構(gòu)效關(guān)系提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯 購自山東省濟南市千佛山農(nóng)貿(mào)市場;鹽酸、甲醇、乙酸乙酯 分析純，天津廣成化學試劑有限公司;乙腈 色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司; DPPH自由基 美國Sigma公司。

KQ3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SP－722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;Agilent 1100LC液相色譜儀、Agilent 6520四級桿－飛行時間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀(Q－TOF)美國Agilent公司;AUW220D電子分析天平 日本Shimadzu公司;BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司等。

1.2 花色苷的提取

花色苷的提取參考Longo等的方法［9］略有改動。新鮮紫薯在4℃打漿，準確稱取100.0g，加入300mL甲醇溶液(含0.1%鹽酸)、室溫下超聲提取3次，每次20min。布氏漏斗真空抽濾，濾渣再用100mL甲醇溶液(含0.1%鹽酸)重復(fù)提取兩次，分別將3次濾液合并，45℃下真空濃縮去除甲醇，最后用水(含0.01%鹽酸)定容至50mL，備用。

1.3 紫薯花色苷的凈化處理

首先使用石油醚對紫薯花色苷粗提物進行萃取，去除提取物可能含有的脂溶性成分，然后采用乙酸乙酯萃取，去除提取物中存在的黃酮。選擇XAD－7樹脂對紫薯花色苷粗提物進行純化，以利于進一步的分析。

1.4 紫薯花色苷的液相分析條件

Agilent TC－C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，二元梯度洗脫，流動相A為水(含0.4%甲酸)，B為乙腈。程序為:0min，90%A:10%B;0～5min，B相從10%升至17%;5～30min，B相保持17%不變;30～35min，B相從17%升至100%。進樣10μL，流速1mL/min，柱溫25℃，檢測波長517nm。

1.5 花色苷的質(zhì)譜分析條件

離子源API－ESI，正、負離子兩種檢測模式，四極桿溫度100℃，霧化壓力0.241MPa，碎裂電壓175V，干燥氣溫度350℃，干燥氣流量10L，毛細管電壓4kV，碰撞能量20V，m/z掃描范圍100～1700。

1.6 抗氧化活性的測定

將不同體積的紫薯花色苷提取液(相當于2g鮮重/mL的花色苷提取液)100、200、400、600、800μL分別加入4mL 0.04mg/mL DPPH自由基甲醇溶液中，

其中:At為加入提取液后的DPPH自由基的吸光值;A0為加入50%丙酮的DPPH自由基的吸光值。用50%丙酮定容至5mL，振蕩搖勻，30min后用溶劑作參比，采用分光光度法在517nm處測定吸光度。

提取物清除DPPH·自由基能力的計算公式為:

1.7 花色苷單體抗氧化活性的篩選及比較

參考Tang等的方法［10］略有改動。分別取2份紫薯花色苷提取液1mL于10mL具塞試管中，加入3mL甲醇溶液和3mL 0.04mg/mL的DPPH甲醇溶液，搖勻，30min后同條件下進行HPLC測定。根據(jù)HPLC峰面積歸一化法計算517nm下花色苷提取液中各花色苷的峰面積，計算消減率。根據(jù)消減率的大小，可比較得出各物質(zhì)之間的抗氧化差異。

其中:A反應(yīng)前為加入甲醇溶液的的峰面積值;A反應(yīng)后為加入DPPH自由基甲醇溶液后的峰面積值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯花色苷物質(zhì)的定性分析

2.1.1 紫薯花色苷的液相圖譜 花色苷是類黃酮化合物，在可見光區(qū)和紫外區(qū)的最大吸收波長分別為500～540nm和275nm附近，可通過測定色素的最大吸收波長判斷是否為花色苷類色素［11］。圖1為紫薯花色苷提取物在517nm檢測波長下的高效液相色譜圖。6個色譜峰的紫外－可見光譜圖見圖2。由圖2可知，這6個色譜峰在500～540nm和275nm處都有最大吸收，因此可以確定它們都是花色苷類化合物。

圖1 紫薯花色苷提取物的高效液相色譜圖(波長517nm)Fig.1 HPLC chromatogram of anthocyanins in purple sweet potato at 517nm

2.1.2 紫薯花色苷的HPLC－ESI/Q－TOF－MS/MS分析 按照上述的質(zhì)譜條件，獲得了紫薯中主要花色苷色譜峰的分子離子及二級碎片離子。根據(jù)正離子模式下色譜峰的一級質(zhì)譜的分子離子和二級質(zhì)譜離子碎片，獲得化合物的準確分子量信息，分析每個譜峰，確定可能的分子量，并與文獻報道的成分進行比較，從而推測出了色譜峰的組成(表1)。

由表1可以看出，紫薯中的六種花色苷分別為矢車菊－3－(阿魏酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷，飛燕草－3，5－雙葡萄糖苷，飛燕草－3－接骨木二糖苷－5－葡萄糖苷，矮牽牛花－3－(p－香豆酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷，矮牽牛花－3－(阿魏酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷和錦葵－3－(p－香豆酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷，其中矮牽牛花－3－(p－香豆酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷的含量最為豐富。

表1 紫薯中主要花色苷的HPLC/MS數(shù)據(jù)Table 1 HPLC/MS data of the main anthocyanins from purple sweet potato

圖2 6個色譜峰的紫外－可見吸收圖譜Fig.2 UV－Vis spectra of peaks

2.2 紫薯花色苷的抗氧化能力

DPPH自由基是一種深紫色的穩(wěn)定自由基，其甲醇溶液為紫色并在517nm附近有強的吸光值，當被抗氧化劑還原，或與另外一個自由基結(jié)合時，轉(zhuǎn)化為無色的1，1－二苯基－2－三硝基苯胺，吸光值都會降低，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此可用自由基的清除情況來評價某物質(zhì)的抗氧化能力，其抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化能力越強。由圖3可以看出，紫薯花色苷提取液對DPPH自由基具有較強的清除能力，半抑制濃度為0.475mg/mL。

圖3 紫薯花色苷提取液的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity of anthocyanins from purple sweet potato

2.3 紫薯花色苷組分抗氧化能力的比較

根據(jù)HPLC峰面積歸一化法在517nm下花色苷提取液中各花色苷在DPPH自由基清除前后的峰面積，計算消減率。經(jīng)過DPPH反應(yīng)后，具有抗氧化能力的花色苷成分的峰面積將減小。消減率越大，花色苷成分的抗氧化能力越強，據(jù)此可實現(xiàn)果蔬中花色苷成分的抗氧化篩選與比較。

由圖4和表2可以看出，紫薯中6個花色苷均具有一定的抗氧化能力。但與DPPH自由基反應(yīng)后，花色苷的峰面積發(fā)生了顯著不同程度的消減，消減率在3%～69%之間，說明各個花色苷組分之間的抗氧化能力存在著比較大的區(qū)別，其中飛燕草－3，5－雙葡萄糖苷的抗氧化能力最強，消減率達到68%以上，矮牽牛花－3－(p－香豆酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷和矮牽牛花－3－(阿魏酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷差別不大，在13%～15%左右，而另外三種花色苷反應(yīng)前后的消減率均低于6%。盡管矮牽牛花－3－(p－香豆酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷的含量超過花色苷總峰面積的80%，且對DPPH自由基的清除能力處在第二位，但僅為15.25%，遠低于較低含量的飛燕草－3，5－雙葡萄糖苷的68.57%。

表2 紫薯中主要花色苷的抗氧化能力比較Table 2 Comparison of antioxidant activity of main anthocyanins from purple sweet potato

圖4 反應(yīng)前后紫薯中花色苷的液相圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of anthocyanins in purple sweet potato before＆after reaction

3 討論

3.1 花色苷類抗氧化活性物質(zhì)的分析方法

目前，研究者評價植物花色苷組成往往只能通過測定總花色苷含量來進行評價，同時花色苷單體物質(zhì)的獲得非常困難，對起抗氧化作用的具體花色苷尚無法準確分析和鑒定，這已成為花色苷研究中的一個難點。目前，花色苷的鑒定方法包括紙層析法、水解分析法、紫外－可見光譜法、紅外吸收光譜法、質(zhì)譜法等。但這些方法在分析鑒定花色苷時也面臨著分析測定不夠準確，分析工作較為繁瑣，分析周期長等缺點。

近年來，人們開始采用高效液相－質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC－MS)技術(shù)來檢測果蔬中的抗氧化物質(zhì)［16］，但對于花色苷類物質(zhì)的檢測尚沒有報道。另外還有一些在線HPLC檢測植物提取物中抗氧化活性物質(zhì)的方法報道，主要是基于在線檢測抗氧化物質(zhì)與自由基反應(yīng)的柱前衍生化技術(shù)［17］，這些方法由于在線檢測儀器設(shè)備的復(fù)雜性和難以商業(yè)化而無法得到推廣。Shui等［18］研發(fā)了一種通過與自由基淬滅反應(yīng)后利用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用檢測生物樣品中的主要抗氧化黃酮類物質(zhì)的方法，即首先將提取液與自由基進行反應(yīng)，比較衍生與未衍生的液相色譜峰的差異，再根據(jù)其質(zhì)譜信息確定抗氧化黃酮類物質(zhì)，如ABTS－HPLC－DAD－MS聯(lián)用［19］和DPPH－HPLC－DAD－MS聯(lián)用技術(shù)［10］。這些方法為抗氧化活性花色苷的快速分析和鑒定指明了方向。本文為這項技術(shù)在花色苷的分析和鑒別中的應(yīng)用做出了有益的嘗試，從實驗的結(jié)果可以看出，盡管矮牽牛花－3－(p－香豆酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷的含量超過總花色苷的80%，且對DPPH自由基的清除能力處在第二位，但僅為15.25%，遠低于較低含量的飛燕草－3，5－雙葡萄糖苷。在分離純化抗氧化花色苷的過程中，低含量而高活性的花色苷容易被忽視，本方法的建立可從分離純化工作的開始就避免此類問題的發(fā)生，有利于篩選和分離出最高活性的物質(zhì)。這有助于實現(xiàn)抗氧化活性物質(zhì)的快速鑒定和分析，也為其它生理活性的研究提供了思路，這對闡明食品加工中活性花色苷的降解過程及其機制，揭示生物活性與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系具有重要的意義。

3.2 花色苷抗氧化活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

天然產(chǎn)物的構(gòu)效關(guān)系研究一直是食品科學領(lǐng)域的研究熱點。一般認為，花色苷六大基本構(gòu)成的抗氧化能力排序為:天竺葵色素＞矢車菊色素＞飛燕草色素＞芍藥色素＞牽牛花色素＞錦葵色素，但酰基化、糖苷配基、甲基化、羥基數(shù)目以及半兒茶結(jié)構(gòu)等均有很大的關(guān)系，比如，羥基數(shù)量越多，抗氧化性能越強;葡萄糖苷配基的數(shù)量多，抗氧化性能越強［20－21］;C3的配糖酰基化有可能會降低花色苷的抗氧化能力［22］。由圖4和表2可看出，盡管紫薯花色苷組分均具有較強的抗氧化能力，但它們之間仍存在著巨大的差異，其中飛燕草－3，5－雙葡萄糖苷的抗氧化能力最強，矮牽牛花－3－(p－香豆酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷和矮牽牛花－3－(阿魏酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷次之，而錦葵花色素的抗氧化能力最弱，這與上述的研究結(jié)果基本一致。

本方法的提出，可以實現(xiàn)花色苷抗氧化活性的快速鑒別，從而為進一步的分離和純化活性強的化合物指明了方向，體現(xiàn)活性指導(dǎo)下的物質(zhì)分離與純化的技術(shù)思想，從而提高效率，減少消耗。

4 結(jié)論

采用柱前自由基衍生化反應(yīng)，結(jié)合HPLC－MS技術(shù)，實現(xiàn)了紫薯中6種抗氧化花色苷物質(zhì)的快速分離、鑒定和比較，發(fā)現(xiàn)飛燕草－3，5－雙葡萄糖苷的抗氧化能力最強，矮牽牛花－3－(p－香豆酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷和矮牽牛花－3－(阿魏酰基)－雙葡萄糖苷－5－葡萄糖苷次之，而錦葵花色素的抗氧化能力最弱。

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Rapid identification of antioxidant activity anthocyanins in purple sweet potato by pre－column DPPH free radical－h(huán)igh performance liquid chromatography－mass spectrometry

FU Mao－run1，HE Zhi－ping2，ZHAO Shuang1，LIU Yu－qin3，LIU Xiu－h(huán)e1，WANG Xiao4，*
(1.College of Food Science and Bioengineering，Shandong Polytechnic University，Ji’nan 250353，China;
2.Department of Food Science，Zhejiang Forestry College，Lin’an 311300，China;
3.Shandong Arura Pharmceutical Research＆Development Co.，Ltd.，Ji’nan 250100，China;
4.Shandong Analyz and Test Center，Shandong Academy of Sciences，Ji’nan 250001，China)

To establish a new method which could analysis，identify and compare the antioxidant activity quickly and accurately，purple sweet potato as experimental material，combination of pre－column derivatization reaction with DPPH(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl)free radical and HPLC－MS were used to analysis the characteristic peaks of anthocyanins in purple sweet potato with antioxidant activity，then，structure identification was done by HPLC－MS.Six anthocyanin compounds were identified in purple sweet potato and the relationship between structure and antioxidant activity was expanded that delphinidin－3，5－diglucoside was the strongest and other five compounds were more poor.Establishment of the method would help to identify anthocyanin compounds quickly，which provided theory and technical support for anthocyanin compounds to investigate their natural structure in food and flowers，and expand their structure－activity relationship.

antioxidant activity;anthocyanins;pre－column derivatization reaction;purple sweet potato

TS255.1

A

1002－0306(2012)21－0125－05

2012－04－11 *通訊聯(lián)系人

傅茂潤(1981－)，男，博士，副教授，研究方向:食品科學。

山東省大型儀器升級改造項目(2011SJGZ30);浙江省公益性項目(分析測試)(2011C37067)。