產菊粉酶菌株的篩選及產酶條件優化

黃玉玲，王桂峰，隆小華，*，劉兆普，王 琳，王 博

(1.南京農業大學江蘇省海洋生物學重點實驗室，江蘇南京 210095;

2.山東省農墾科技發展中心，山東濟南 250014)

產菊粉酶菌株的篩選及產酶條件優化

黃玉玲1，王桂峰2，隆小華1，*，劉兆普1，王 琳1，王 博1

(1.南京農業大學江蘇省海洋生物學重點實驗室，江蘇南京 210095;

2.山東省農墾科技發展中心，山東濟南 250014)

從鹽堿地菊芋根際土壤中篩選出112株產菊粉酶菌株，并從中得到一株酶活較高的真菌A－6，經菌落觀察以及采用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR擴增RNA基因序列，測序鑒定結果為煙曲霉Aspergillus fumigatus。對其產酶條件進行單因素分析結果顯示，真菌A－6的pH耐受范圍較廣，且具有一定的耐鹽性。經正交實驗進行產酶條件優化，確定了A－6的最佳產酶條件為菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl為5g/L，NH4H2PO45g/L，pH為5，30℃，170r/min下振蕩培養3d，酶活最高為13.29U/mL。

篩選，菊粉酶，煙曲霉，產酶條件，優化

菊芋(Helianthus tuberosus)又名洋姜，適應性廣、耐貧瘠、耐鹽堿。菊芋塊莖中80%為菊粉(Inulin)。菊粉又稱菊糖，是一種果聚糖，由果糖在1分子蔗糖上以β－2，1連接而成，聚合度30左右［1］，分子量3000～5000碳單位。菊粉可水解生成果糖，酸法水解產量較高，但成本高且無機離子含量高。酶法水解具有方法簡便、成本低、產物純度高的優點，所以菊粉酶的研究成為熱點［2－3］。八十年代，國外便開始了酶法水解菊粉生產果糖漿的研究，先后開展了菌株篩選、酶學性質以及工業生產固定化技術等研究［4－5］。我國菊粉酶的相關研究起步較晚，但大部分工作僅停留在菌株篩選以及酶學研究階段，但由于產酶量和某些作用機制的問題［6］，尚未有成功應用于工業發酵生產的報道，因此進一步篩選性能優良的高產菌株仍然十分必要。菊粉酶(Inulinase)能夠通過外切或內切的方式水解菊粉，分別生成低聚果糖或果糖［7］。多種微生物如酵母菌、霉菌和細菌均能合成菊粉酶［8］。國內外菊粉酶菌株的研究主要集中在霉菌和酵母兩類真菌，酵母菌中研究最多的是子囊菌亞門的克魯維酵母屬(Kluveromyces)［9－10］。霉菌的研究主要集中在曲霉(Aspergillus)［11－12］、青霉屬(Penicillium)［13］。本研究旨在篩選高產野生產菊粉酶菌株，通過單因子分析和正交實驗，對其進行產酶發酵條件的摸索與優化，為以后酶學性質的研究，菊粉酶基因的克隆和工程菌轉化等進一步研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

篩菌樣品 采自江蘇大豐、山東東營、黑龍江大慶的菊芋根際土壤;菊芋塊莖 取自江蘇大豐南京農業大學菊芋中試基地;菊芋提取液(EJA) 將粗菊粉與蒸餾水按1∶4比例混勻，80℃熱浸提1h壓濾;菊粉 分子量約5000，購于德國Fluka公司;果糖、3，5二硝基水楊酸(DNS) 國藥集團化學試劑有限公司，分析純;其他試劑 均為化學純;初篩培養基(g/L) 菊芋提取液(EJA)70，K2HPO41.0，MgSO4· 7H2O 0.5，NaNO31.5，NH4H2PO42.0，KCl 0.5，FeSO4· 7H2O 0.1，瓊脂20，pH6;115℃濕熱滅菌30min;復篩培養基(g/L) 菊芋提取液120，蛋白胨10，NH4H2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 5.0，pH6; 115℃濕熱滅菌30min;斜面保藏培養基(PDA，g/L)

馬鈴薯200、葡萄糖15、瓊脂20。

1.2 菌株篩選

1.2.1 菌株初篩 稱取一定量的土樣置于含有無菌水和玻璃珠的三角瓶中，30℃，170r/min搖床振蕩30min，吸取一定量的土壤懸液于初篩培養基，涂布平板并在28℃下培養2～7d，挑取透明圈直徑大的菌落，接種至PDA平板培養基上進行分離純化后，斜面保存備用。

1.2.2 復篩實驗 將初篩得到的菌株，接入裝有50mL復篩培養基的三角瓶中。真菌的接種量為直徑0.5cm的菌落，30℃，170r/min搖床培養72h后，用濾紙過濾，棄出菌絲，得到粗酶液。細菌接入量為5%(v∶v)，37℃，170r/min搖床培養24h后，將發酵液10000r/min離心15min，取上清液即為粗酶液。測定粗酶液酶活，從中選取酶活較高的菌株。

1.3 酶活的測定［14］

取適當稀釋的粗酶液0.2mL與0.8mL 2%菊糖(用0.1mol/L，pH4.6醋酸緩沖液配制)在55℃條件下反應20min后，于100℃加熱5min終止酶反應，然后取1mL的反應液用DNS顯色法［15］測定產物中還原糖的量。在相同的條件下，用100℃滅活的粗酶液作為對照。菊粉酶酶活力定義為pH4.6，55℃下反應20min，每分鐘轉化成1μmol還原糖的酶量為一個酶活單位。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌落觀察 采用點植孢子懸液的方法，制備一定濃度的孢子懸液，用接種環或移液槍分別點種在培養基上(重復5板)，并將此平板倒置于28℃恒溫培養，連續幾天跟蹤觀察菌落特征。

1.4.2 分子生物學鑒定 將平板中培養的菌種轉接到裝有50mL PDA液體培養基的三角瓶中，30℃，170r/min培養5d后，過濾，取菌絲加液氮充分研磨后，迅速轉移至1.5mL離心管中，采用OMEGA公司的E.Z.N.ATM.真菌提取試劑盒進行提取基因組DNA。

采用通用引物進行真菌核糖體RNA的PCR擴增:其中ITS rDNA擴增引物為 ITS1和ITS4［16］，ITS1的堿基序列為5'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3'，ITS4堿基序5'－TCCTCCGCCTTATTGATATGC－3'［17］。PCR擴增體系為:10×buffer(不含Mg2+)5μL，dNTPs (各2.5mmol/L)4μL，引物各1μL，模板4μL，MgCl2(25mmol/L)2.5μL，Taq酶(2.5U)0.1μL，加ddH2O至50μL。PCR條件為:94℃預變性3min;94℃變性30s; 50℃退火45s;72℃延伸1min;35個循環;72℃延伸7min。PCR產物于0.8%瓊脂糖膠電泳檢測后4℃保存待測，測序工作均由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.5 產菊粉酶條件的優化

1.5.1 單因素實驗

1.5.1.1碳源對產酶的影響 將菌種接于裝有100mL復篩培養基的三角瓶中，分別用20g/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖、玉米面、菊粉、菊芋提取液作為單一碳源，30℃，170r/min下振蕩培養3d后分別測定酶活，選取最佳碳源。

1.5.1.2 氮源對產酶的影響 采用上述實驗所得最佳碳源，分別用20g/L的酵母膏、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏和5g/L的NH4H2PO4、NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NH3為氮源，培養條件同上測定酶活，選取最佳氮源。

1.5.1.3 無機鹽對產酶的影響 采用上述實驗所得最優碳源和氮源，分別采用不同的無機鹽:5g/L的NaCl、KCl、CaCl2，0.1g/L的MgSO4·7H2O、CuSO4· 5H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4、ZnSO4·7H2O，其他條件同上測定酶活，選取最佳無機鹽。

1.5.1.4 pH對產酶的影響 上述各因素確定后，采用不同的初始pH3、4、5、6、7、8、9，培養后測定酶活，確定最佳的初始pH。

1.5.2 正交實驗 根據上述單因素實驗結果，確定對酶活影響較大的幾個因素，如表1采用L16(44)正交表對菊芋提取液、酵母膏、NaCl的濃度和pH進行正交實驗，以確定最終的適宜培養條件。

表1 正交實驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 結果與分析

2.1 產菊粉酶菌株的篩選

經菌株初篩，共篩選出可利用菊粉的菌株112株，其中真菌41株，細菌71株，表2列出了酶活最高的10株菌的測定結果，可以看出雖然細菌在數量上占有優勢，但是真菌的酶活普遍高于細菌，其中真菌A－6的酶活最高為5.30U/mL，因此本研究選取真菌A－6為后續實驗菌株。

2.2 菌株鑒定

菌落形態特征:如圖1所示，A－6菌在PDA培養基上28℃培養5d，菌落半徑達到3.6～4.7cm，邊緣整齊呈圓形，絲絨狀并產生藍綠色的孢子。

分子鑒定:A－6菌株 PCR產物測序結果與GeneBank中已知菌株序列比對，結果顯示該菌與煙曲霉屬的同源性均在98%以上。運用ITS序列構建最大簡約樹，結果如圖2所示，分支處的數值為支持強度，A－6與Aspergillus fumigatus(gi226973986)聚成一支，在所有比對結果中，A－6與Aspergillus fumigatus(gi226973986)的同源序列相似率最高，故鑒定該菌為煙曲霉屬(Aspergillus fumigatus.)。

2.3 單因素實驗

從圖3可以看出，以菊芋提取液為碳源時，菌株的酶活可達到4.02U/mL，明顯高于其他碳源，而且比高聚合度的純菊粉為碳源時產酶活性高。菊芋提取液中有少量的低聚合度的果糖，可能是Aspergillus fumigatus A－6的產酶誘導物。

表2 部分菌株的酶活Table 2 Inulinase activity of 10 strains

圖1 菌株A－6的單菌落形態Fig.1 Shape of individual bacterial colony of strain A－6

圖2 菌株A－6的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A－6

圖3 不同碳源對菌株產酶的影響Fig.3 The effect of different carbon sources on enzyme production

由圖4可以看出，有機氮源中，酵母膏作為氮源時，菌株的酶活最高為6.84U/mL，要高于其他的氮源。無機氮源對菌株產酶影響差異不大，采用NH4H2PO4作為氮源時，菌株酶活最高為2.87U/mL，因其中含有P元素，既可以做氮源又可以做磷源，所以用NH4H2PO4為氮源時Aspergillus fumigatusA－6的酶活要高于其他無機氮源。

如圖5可以看出，采用KCl和NaCl時菌株酶活均為6.32U/mL，Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+對于菌株的酶活起促進作用，相反的 Ca2+和 Cu2+則對Aspergillus fumigatusA－6酶活有著相對的遏制作用。

從圖6可以看出，菌株Aspergillus fumigatusA－6的pH耐受范圍較廣，在pH為3時仍能表現出一定的酶活，其最適pH為5，此時的酶活最高可達到7.7U/mL，隨著pH的升高其酶活逐漸降低，pH為9時酶活仍為3.83U/mL。

圖4 不同氮源對菌株產酶的影響Fig.4 The effect of different nitrogen sources on enzyme production

圖5 不同無機鹽對菌株產酶的影響Fig.5 The effect of different inorganic salt on the production of inulinases

圖6 不同pH對菌株產酶的影響Fig.6 The effect of pH on enzyme production

2.4 正交實驗

正交實驗結果由表3和表4可以看出，各個因素對菌株酶活的影響大小順序依次為:菊芋提取液(EJA)＞pH＞酵母膏(YE)＞NaCl，根據各個組合酶活力確定出最優組合是A3B4C2D1;但是根據K值，A因素的最佳條件為A4，此時的最優組合為A4B4C2D1，此組合未出現在正交實驗中，需要進行實驗驗證，以比較兩個組合的效果，確定最優產酶條件。

按正交實驗所得的兩組產酶組合，對Aspergillus fumigatusA－6同時進行3批次的產酶培養，測得酶活結果見表5，可看出最佳產酶組合為A3B4C2D1，該組合培養基組分為菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl為5g/L，NH4H2PO45g/L，pH為5，此時菌株的酶活的平均值為13.27U/mL，實驗結果具有較好的穩定性。

表3 正交實驗結果Table 3 Results and analysis of orthogonal design

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

表5 正交實驗驗證Table 5 Verification of orthogonal design

3 結論

本研究自菊芋鹽堿地種植土壤中篩選得到112株產菊粉酶菌株，并從中得到酶活較高的真菌A－6，分子鑒定結果顯示該菌為煙曲霉Aspergillus fumigatus，煙曲霉產菊粉酶的研究國內報道較少，此研究豐富了產菊粉酶菌株的種類。對產酶條件的單因素實驗顯示碳源菊芋提取物，有機氮源酵母膏和無機氮源NH4H2PO4對于菌株酶活的影響較大，真菌A－6的pH適應范圍較廣，為pH5～9。綜合正交實驗的分析結果，真菌A－6的最佳發酵產酶培養條件為菊芋提取液(EJA)100g/L，酵母膏(YE)25g/L，NaCl為5g/L，NH4H2PO45g/L，pH為5，30℃，170r/min下振蕩培養3d，此時酶活測定結果為13.29U/mL，與單因素實驗時的酶活相比，提高了72%。另外，驗證實驗顯示，正交實驗所得的最佳培養條件下，菌株的酶活相對穩定。可以看出通過正交優化，真菌A－6的酶活可得到顯著提高，并且該菌的pH適應范圍較寬，具有菌株改良以進一步提高酶活的潛力，本研究豐富了產菊粉酶菌株的品種資源，為產菊粉酶基因的后續克隆與轉化，乃至工業化應用研究提供了理論和實驗基礎。

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Screening of inulinase production strain and optimization of fermentation condition

HUANG Yu－ling1，WANG Gui－feng2，LONG Xiao－hua1，*，LIU Zhao－pu1，WANG Lin1，WANG Bo1
(1.Key Laboratory of Marine Biology of Jiangsu Province，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China; 2.Shandong Province Agricultural Science and Technology Development Center，Ji’nan 250014，China)

112 strains producing inulinase were isolated from rhizosphere soil of Jerusalem artichoke in the saltaffected land.Strain A－6 was obtained and identified asAspergillus fumigatusthrough observing its shape of individual bacterial colony and amplified the rRNA gene sequence using fungal universal primers ITS1 and ITS4.The effect of different factors on its enzyme production shown A－6 had a wide pH range and it could tolerate the high concentration of NaCl.After analysis of orthogonal design，the optimum condition for higher inulinase production of A－6 was determined:EJA 100g/L，YE 25g/L，NaCl 5g/L，NH4H2PO45g/L，pH5，3d of growth under 30℃ and 170r/min in shake cultures.Maximal inulinase activity of A－6 was 13.29U/mL.

screening;inulinase;Aspergillus fumigatus;fermentation condition;optimizing

TS201.3

A

1002－0306(2012)21－0160－04

2012－03－13 *通訊聯系人

黃玉玲(1986－)，女，碩士，研究方向:菊粉酶菌株與菊芋發酵。

國家科技支撐項目(2011BAD13B09);江蘇省科技支撐項目(BE2010305和BE2011368);公益性行業(農業)科研專項經費項目(200903001－05);中央高校基本業務費項目(Y0201100249);教育部博士點基金(20100097120016)。