纖維素酶系堿性條件下的選擇性失活及應用

徐 勇，蔡 鵬，范 麗，杭 琪，勇 強，2，余世袁，2

(1.南京林業大學化工工程學院，江蘇南京 210037;

2.林木遺傳與生物技術教育部重點實驗室，江蘇南京 210037;

3.江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室，江蘇南京 210037)

纖維素酶系堿性條件下的選擇性失活及應用

徐 勇1，2，3，蔡 鵬1，2，3，范 麗1，2，3，杭 琪1，勇 強1，2，余世袁1，2

(1.南京林業大學化工工程學院，江蘇南京 210037;

2.林木遺傳與生物技術教育部重點實驗室，江蘇南京 210037;

3.江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室，江蘇南京 210037)

里氏木霉產纖維素酶系中的內切葡聚糖酶(CMCase)、纖維二糖水解酶(CBH)和β－葡萄糖苷酶三大酶類在堿性處理條件下會發生快速、選擇性失活。在pH9.00和(25±1)℃的條件下靜置處理纖維素酶液30min，CMCase和CBH酶組分主要發生可逆變性失活，而β－葡萄糖苷酶發生不可逆變性失活，它們的殘余酶活力分別為58.8%、56.6%和5.7%，相對比例可達到10.3和9.9。通過堿性處理能夠得到低β－葡萄糖苷酶活力的纖維素酶制劑，可以顯著提高其定向酶水解纖維素制備纖維低聚糖的生產性能，并生成以纖維二糖為主包括少量纖維三糖的纖維低聚糖。以0.1% (v/v)堿處理纖維素酶定向水解10g/L紙漿24h，纖維低聚糖的酶解得率為6.73%，占總糖類的78.2%，比天然酶反應體系提高53.6%。

纖維素酶系，里氏木霉，酶選擇性失活，定向酶水解，纖維低聚糖

里氏木霉(Trichoderma reesei)是研究和制備纖維素酶最常用的經典菌株之一［1－2］，通過底物的誘導和發酵調控作用它可以分泌出多種不同類型的聚糖水解酶蛋白組分，進而組成不同的酶系或復合酶系。其中纖維素酶系中主要包括內切葡聚糖酶(endo－1，4－β－D－glucanase，EC3.2.1.4，簡稱EG)、外切葡苷聚糖酶(exo－1，4－β－D－glucanase，EC3.2.1.91，又稱CBH)和纖維二糖酶(β－1，4－D－glucosidase，EC3.2.1.21，又稱β－葡萄糖苷酶，簡稱β－G或BG)三大酶系，目前已經共發現了8個EG(EGI～EGVIII)、2個CBH(CBHI和CBHII)和7個BG(BGI～BGVII)酶家族［3－5］。在木質纖維原料聚糖類的酶水解過程中，通過上述三大酶系的協同作用可以催化纖維素或半纖維素為聚糖最終水解生成單糖［2－3，5］。隨著功能性多糖和低聚糖類在細胞生物合成和調控、食品、保健品、醫藥和飼料等領域的基礎研究和應用的快速發展，聚糖定向酶水解技術的研究和開發備受關注，對具有單一功能或催化活性的酶家族或酶組分的需求日益增長［6－8］。目前采用的主要技術途徑一是通過外源單一內切酶或外切酶基因的重組表達，二是對天然酶制劑進行蛋白質拆分以控制和除去纖維素系中的BG酶組分［3，8－9］，它們在大規模工業化生產中存在著技術復雜、研發周期長、設備及操作要求高、前期投入和運行成本高等不足，因此尋求簡單低廉的酶組分活力的定向控制技術和方法具有重要的理論和實用價值［3，10－12］。本研究以里氏木霉產天然纖維素酶復合酶系為實驗材料，采用簡單的pH處理的方法對其三大酶系進行選擇性失活處理，并對處理后酶制劑的多聚糖定向酶水解性能進行了檢測和分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

里氏木霉(Trichoderma reeseiRut C－30) 南京林業大學選育保藏;色譜檢測用葡萄糖和纖維低聚糖的標準品 德國Magazyme公司;蛋白質電泳測定用標準物(SM0431) Fermentas生命科學公司;其它試劑 Sigma公司和上海國藥集團。

高效液相色譜儀 配備Bio－Rad HPX－87H色譜柱(7.8mm×300mm)及保護柱，美國Agilent 1200;高效液相離子交換色譜儀 配備CarboPacTMPA200陰離子交換色譜柱(3mm×250mm)及保護柱，美國Dionex ICS－3000;E24R型臺式恒溫振蕩搖床 美國NBS公司;723N型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R型冷凍離心機 美國熱電公司;Memmer WNB22恒溫振蕩水浴 德國美爾特公司;Tanon 3500R全自動數碼凝膠圖像分析系統 上海天能公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 纖維素酶發酵制備 采用Mandels營養鹽添加12g/L紙漿和蒸汽爆破玉米秸稈混合底物為碳源［13］，在250mL玻璃搖瓶中裝液45mL并接入5mL活化后的里氏木霉菌絲體，于30℃和170r/min振蕩發酵產酶96h得發酵液，經4000r/min離心10min后取上清液即得到纖維素酶原液，分裝后冷凍保藏備用。

1.2.2 酶活力測定 采用雙平行實驗，控制平行誤差≤5%。濾紙酶活力、內切葡聚糖酶活力(CMCase)、外切葡聚糖酶活力(CBH)［14］均采用DNS法測定，β－葡萄糖苷酶(BG)采用對硝基苯酚葡萄糖苷法測定［15］。上述各種酶活力測定均采用0.05mol/L檸檬酸—氫氧化鈉緩沖液體系(pH4.80)和(50± 1)℃。纖維素酶原液中上述各種酶活力值依次為5.81FPIU/mL，38.01、3.60、1.13IU/mL。

1.2.3 酶組分堿性失活 采用雙平行實驗，控制平行誤差≤5%。在恒溫水浴和溫和攪拌的條件下，向纖維素原酶液中緩慢滴加少量10%(v/v)NaOH溶液，調節pH至穩定值，密封靜置處理一定時間后得處理后的酶液，再采用酶活力測定方法重新測定處理后酶液的三種酶組分的酶活力。殘余酶活力的計算方法:以處理前后酶液的各種酶活力測定值相對百分比來表示。堿性處理后纖維素酶液離心分離實驗條件:8000r/min離心堿性處理后的纖維素酶液10min后完全傾出離心上清液，以10%(v/v)體積的檸檬酸緩沖液(pH4.80)清洗離心管壁得離心沉淀物。

1.2.4 酶組分的SDS－PAGE檢測 濃縮膠濃度5.0%，分離膠濃度12.0%，上樣量10μL，樣品蛋白質上樣濃度為0.1～1.0mg/mL，電場強度120V/cm。電泳時間濃縮膠20min，分離膠60min。

1.2.5 酶水解性能的檢測 采用雙平行實驗，控制平行誤差≤5%。在100mL螺口玻璃三角瓶中進行，加入0.05mol/L檸檬酸緩沖液(pH4.80)配制而成的10g/L Whatman濾紙紙漿粉(20目)溶液25mL作為酶解底物，再加入適量酶液并密封，于(50±1)℃和100r/mim振蕩反應。定時取樣0.5mL加入10μL的1%(v/v)H2SO4終止酶反應得酶水解產物，經適當稀釋后進行色譜分析。酶解得率計算:以水解反應體系中所測定的產物糖的物質濃度除以紙漿的初始物質濃度再乘以轉換系數0.9。

1.2.6 酶水解產物的色譜分析 葡萄糖的測定依照NREL方法［16］采用高效液相色譜法;纖維低聚糖的分析測定采用高效液相離子交換色譜—脈沖安培法［17］。

2 結果與討論

2.1 纖維素酶系的堿性條件下失活機制

在25℃的恒溫條件下，直接添加4.0%NaOH試劑(w/w)調節纖維酶系的pH并靜置處理60min后，測定三大酶組分的酶活力變化規律如圖1－a所示。

結果顯示，在不同pH的堿性處理條件下，三大酶類的酶活力呈現出兩種不同類型的變化特征。以pH8.00以分界點，CMCase為兩段階梯式變化，而CBH和BG則為線性衰減。pH5.00～7.00的范圍內，CMCase和 CBH的酶活力相對較為穩定，可保留90%以上，而BG酶類的酶活力穩定性略低，繼續提高pH導致CBH和BG的酶活力快速線性下降。在高于pH8.00的環境中CMCase的酶活力相對較為穩定。當pH增至9.00時，BG的殘余酶活力僅為5.6%，而 CMCase和 CBH仍然可殘留 57.0%和52.1%，CMCase、CBH與β－G的殘留酶活力的相對比率分別為10.3和9.4;至pH10.00時，可以基本上消除BG和90%以上的CBH酶活力，但仍然可以保留48.4%的CMCase酶活力，即可以得到幾乎不含BG酶活力的纖維素酶制劑。

圖1 纖維素酶系堿性失活規律和最適pH的測定Fig.1 Denaturation of cellulase system by alkali treatment and optimum pH value determination

與堿性條件處理相比，最適pH的測定結果表明(圖1－b)，隨著酶反應體系pH的升高，三種酶組分的相對活力同步衰減，即直接調控酶反應體系的pH不能達到選擇性三大酶組分活力的效果。采用Bradford方法測得堿性處理前后的纖維素酶液中總溶解蛋白質的濃度基本不變;CMCase、CBH和BG酶的蛋白質分子量范圍大約為25～120ku［3－5］，SDSPACE電泳結果顯示堿處理前后的纖維素酶系蛋白質譜帶也未發生明顯的變化，僅有少量酶蛋白因離心作用會附著在管壁上(圖2)。

圖2 纖維素酶經堿性處理后的電泳圖譜Fig.2 Electrophonic map of alkali treated cellulase

強堿條件導致酶失活的途徑主要有兩個方面:一是酶構象改變進而導致失活;二是影響底物、酶蛋白分子空間結構中的有關基團或中間絡合物ES的解離狀態，進而導致影響酶的活性或致使底物和酶難以結合，最終影響了酶活力。基于本研究的結果，對天然纖維素酶系堿性條件下的選擇性失活機制作如下推測:較強的堿性條件會使纖維素酶系中的三大酶類均產生蛋白質變性作用，進而導致它們同步失活;由于體系的高pH遠離了它們各自的等電點，各酶蛋白之間存在著同電排斥作用，所以并不會產生沉淀，表現為處理前后的總蛋白質濃度和電泳圖譜無明顯的差異;在pH≥8.00的堿性處理條件下，三大酶類中的CMCase和CBH酶類主要產生可逆變性失活(構象變化)，而BG為不可逆變性失活。當將堿處理后的纖維素酶重新加入到pH4.80的緩沖體系測定酶活力時，CMCase和CBH的構象部分復性并且重新表現出相應的酶活力，而BG的構象和酶活力較難以恢復，最終通過堿性處理可達到纖維素酶系選擇性失活的效果。

2.2 處理溫度和時間對酶系失活的影響

在pH9.00的條件下，將纖維素酶原液分別置于5～40℃恒溫水浴條件下同步靜置處理60min。由圖3－a可知，在pH9.00的堿條件下，低于10℃的處理溫度對BG酶組分存在一定的保護作用，在15～30℃的溫度范圍內堿性pH對纖維素酶液都起到較好的選擇性失活作用，但是超過 30℃的溫度也會導致CMCase和CBH的殘余酶活呈現出下降的趨勢。這有利于纖維素酶在常溫下進行堿處理操作。圖3－b顯示，在pH9.00和(25±1)℃的條件下處理30min后，三種酶類的殘余酶活力就可以達到穩定狀態，其中CMCase、CBH和BG的殘余酶活力分別為58.8%、56.6%和5.7%，相對比例達到10.3和9.9，可實現選擇性失活的效果。堿處理時間超過 70min后，CMCase和CBH的酶活力會表現出下降的趨勢。

圖3 處理溫度和時間對纖維素酶系堿性失活的影響Fig.3 Effects of temperature and time on cellulase denaturation by alkali treatment

綜上可見，相對于其它的酶分離和酶活力調控技術而言，堿性處理可以在常溫條件下快速實現天然纖維素酶系的選擇性失活，具有設備簡單、操作方便和成本低廉的技術優勢，在特定纖維素酶制劑的生產和應用上具有發展前途。

2.3 堿性條件下失活酶系的酶水解性能

分別采用pH9.00和pH10.0的兩種堿性條件在(25±1)℃處理纖維素酶液30min后得到處理后的酶液。以纖維素酶原液為對照，在10g/L紙漿的酶解體系中分別加入0.1%(v/v)用量的兩種酶液，比較3種酶制劑的酶水解反應歷程如圖4所示。

圖4 堿性條件下處理前后纖維素酶水解動力學的比較Fig.4 Comparison of enzyme kinetics of three enzymes solution

由圖4可知，在低底物和較少酶用量的反應條件下，與原酶液相比，經過pH9.00堿處理后的酶制劑仍然可保存50%以上的CMCase和CBH酶活力，二者對紙漿酶水解反應的動力學和總糖得率基本上相近。由于堿處理可選擇性地抑制酶系中BG酶活力(殘余酶活力5%左右)，因而可以有效地保護紙漿酶水解過程中生成的纖維低聚糖組分。0.1%(v/v)用量的堿處理酶催化水解10g/L紙漿反應24h后，反應體系中各種酶解產物組成基本趨于穩定，對應的總糖酶解得率為8.60%，其中纖維低聚糖的酶解得率為6.73%，低聚糖占總糖的比例由原酶液的50.9%增長到78.2%，提高幅度達到53.6%。這說明，堿性處理對天然纖維素酶系的選擇性失活作用可顯著提高定向水解纖維素制備纖維低聚糖的生產性能，可用于纖維低聚糖的酶法生產。提高酶液堿度至pH10.0會導致三大酶類進一步失活，尤其是CBH顯著失活，造成酶水解性能和低聚糖的得率大幅度下降，但對酶解產品品質即低聚糖比例的貢獻較小。

采用高效離子液相色譜對酶解產物糖組成的分析結果顯示(如圖5)，采用堿失活纖維素酶水解紙漿只生成纖維二糖和少量的纖維三糖，不會生成其它聚合度的纖維低聚糖，兩種糖分別約占總低聚糖類的90%和10%。

3 結論

3.1 在pH≥8.00的堿性條件下，纖維素酶系中的CMCase和CBH酶類主要產生可逆變性失活，而BG為不可逆變性失活，可采用堿性處理對纖維素酶系的三大酶類進行性失活。

3.2 堿性處理可以在常溫條件下實現天然纖維素酶系的快速、選擇性失活，設備和操作簡單、成本低廉。在pH9.00和(25±1)℃的條件下處理30min后，纖維素酶系中CMCase、CBH和BG的殘余酶活力分別為58.8%、56.6%和5.7%，相對比例可達到10.3和9.9。

圖5 堿處理纖維素酶定向水解紙漿的糖組成Fig.5 Degraded saccharides composition of selective hydrolyzed paper with alkali treated cellulase

3.3 堿性處理可顯著提高纖維素酶定向水解纖維素制備纖維低聚糖的生產性能，可用于纖維低聚糖的酶法生產。以0.1%(v/v)堿處理纖維素酶定向水解10g/L紙漿24h生成以纖維二糖為主包括少量纖維三糖的纖維低聚糖，對應低聚糖類的酶解得率為6.73%并占總糖類的78.2%，較天然酶反應體系可提高53.6%。

［1］Christian P K.Advancesin biochemicalengineering.bioteehnology［M］.Managing Editor:Fieehter A(Springer－Verlag，Berlin Heidelberg)，1992，45:1－27.

［2］Zhang Y H P，Himmel M E，Mielenz J R.Outlook for cellulase improvement:screening and selection strategies［J］.Biotechnology Advances，2006，24:452－481.

［3］Mathew G M，Sukumaran R K，Singhania R R，et al.Process in research on fungal cellulases for lignocellulose degradation［J］.Journal of Scientific and Industrial Research，2008，67:898－907.

［4］Schulein M.Cellulases ofTrichodema reesei，in methods in enzymology［M］.Edited by Wood W A and Abelson J N (Academic Press，New York)，1988，160:234－242.

［5］Bhat M K.Cellulases and related enzymes in biotechnology［J］.Biotechnology Advances，2000，18(5):355－383.

［6］Fort S，Boyer V，Greffe L.Highly efficient synthesis of beta (1－4)－oligo－and－polysaccharides using a mutant cellulase［J］.Journal of the American Chemical Society，2000，122(23): 5429－5437.

［7］Hirayma M.Novel physiological functions of oligosaccharids［J］.Pure Applied Chemistry，2002，74(7):1271－1279.

［8］Peterson Robyn，Nevalainen Helena.Trichoderma reesei RUT－C30－thirty years of strain improvement［J］.MIicrobiology SGM，2012，158:58－68.

［9］Levine Seth E，Fox Jerome M，Clark Douglas S.A mechanistic model for rational design of optimal cellulase mixtures［J］.Biotechnology and Bioengineering，2011，108(1):2561－2570.

［10］Arnold F H，Wintrode P L，Miyazaki K，et al.How enzymes adapt:lessons from directed evolution［J］.Trends in Biochemistry Science，2001，26:100－106.

［11］Arnold FH.Combinatorial and computational challenges for biocatalyst design［J］.Nature，2001，409:253－257.

［12］Schulein M.Protein engineering of cellulase［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2000，1543:239－252.

［13］李志和，張麗，李鑫，等.培養基組成對里氏木霉合成纖維素酶的影響［J］.林產化學與工業，2011，31(3):55－58.

［14］Ghose T K.Measurement of cellulase activities［J］.Pure and Applied Chemistry，1987，59(2):257－268.

［15］Miller J.Experiments in molecular genetics［M］.New York Cold Spring Harbor Laboratory，1972:352－355.

［16］Sluiter A，Hames B，Ruiz，et al.Laboratory technical report (NREL/TP－510－42618).www.nrel.gov/biomass/pdfs/ 42618.pdf，2008.

［17］范麗，徐勇，連之娜，等.高效離子交換色譜－脈沖安培檢測法定量測定低聚木糖樣品中的低聚木糖［J］.色譜，2011，29 (1):75－78.

Selective denaturation of major enzymatic components in cellulase system by alkali treatment and its application

XU Yong1，2，3，CAI Peng1，2，3，FAN Li1，2，3，HANG Qi1，YONG Qiang1，2，YU Shi－yuan1，2
(1.College of Chemical Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China;
2.Key Laboratory of Forest Genetics＆Biotechnology MED，Nanjing 210037，China;
3.Jiangsu Key Lab of Biomass－based Green Fuel＆Chemicals，Nanjing 210037，China)

In the crude cellulase system ofTrihcoderma reesei，three main enzyme groups involving endoglucanase(CMCase)，cellobiohydrolase(CBH)and β－Glucosidase were rapidly and selectively denatured in the alkali circumstance.CMCase and CBH were inclined to reversible denaturation，different from the irreversible denaturation of β－Glucosidase as the crude cellulase was incubated statically in the alkali solution at pH9.00 and (25±1)℃for 30min.The residual enzyme activity value of three enzyme groups were respectively remained 58.8% of CMCase，56.6%of CBH and 5.7%of β－Glucosidase，thus the relative ratio between CMCase or CBH and β－Glucosidase reached 10.3 or 9.9.Alkali treatment improved greatly，the cellulase selectivity and produced the glucosidase－poor cellulase to hydrolyze selectively cellulose into cellooligosaccharides containing mainly cellobiose and little cellotriose.The product yield of cellooligosaccharide could reach 6.73%when 10g/L paper powder solution was hydrolyzed at the enzyme loading of 0.1%(v/v)alkali treated cellulase for 24h.The oligosaccharides content accounted for 78.2%of the total degraded saccharides which increased by 53.6%，compared with the enzymatic hydrolysate with crude cellulase.

cellulase system;Trichoderma reese;selective denaturation of enzyme;selective enzymatic hydrolysis; cellooligosaccharides

Q814.1

A

1002－0306(2012)21－0164－05

2012－04－06

徐勇(1971－)，男，博士，副教授，研究方向:生物工程。

林業公益項目(200904017);國家自然科學基金項目(31070514);江蘇省重大科技支撐項目(BEK2011838);江蘇省高校科技創新團隊資助項目;江蘇省高校優勢資源學科建設工程資助項目。