響應(yīng)面法優(yōu)化水酶法制取調(diào)和油的工藝研究

王 梅，江連洲，2，*，李 楊，2，劉 琪，王勝男，齊寶坤

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030;

2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱 150030)

響應(yīng)面法優(yōu)化水酶法制取調(diào)和油的工藝研究

王 梅1，江連洲1，2，*，李 楊1，2，劉 琪1，王勝男1，齊寶坤1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030;

2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱 150030)

采用擠壓膨化預(yù)處理水酶法提取調(diào)和油，并采用響應(yīng)面法對酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳的酶解條件為:加酶量1.84%、酶解溫度50℃、酶解時間3.3h、物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.6%、酶解pH8。經(jīng)驗證實驗可知，在最優(yōu)酶解工藝條件下，調(diào)和油提取率達(dá)到91.67%。制取的調(diào)和油滿足飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸∶多不飽和脂肪酸=0.46∶1∶1，n－6多不飽和脂肪酸∶n－3多不飽和脂肪酸=4∶1。

響應(yīng)面，擠壓膨化，調(diào)和油

我國現(xiàn)有油脂加工工藝中，以取油為主要目的，較少顧及蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)成分的保護(hù)，加工條件劇烈，油料資源的利用率和附加值較低。以浸出溶劑為主的制油工藝及配套精煉工序，存在潛在的安全和環(huán)境污染、營養(yǎng)素破壞嚴(yán)重、資源再利用效能低等突出問題。然而，水酶法作用條件溫和(常溫、無有機(jī)溶劑、無劇烈化學(xué)反應(yīng))，體系中的降解產(chǎn)物一般不會與提取物發(fā)生反應(yīng)，可以有效地保護(hù)油脂、蛋白質(zhì)以及膠質(zhì)等可利用成分的品質(zhì)［1－6］。隨著人們健康意識的逐步加強(qiáng)，對于食用油的質(zhì)量以及食用油的脂肪酸含量和比例的關(guān)注也開始慢慢增強(qiáng)。國際上也已提出符合健康要求的膳食脂肪酸的比例，如飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)的比值約為 1∶1∶1［7－9］。n－6∶n－3多不飽和脂肪酸的比值約為4～6∶1［10－11］，二十二碳六烯酸(DHA)∶二十碳五烯酸(EPA)的比值約為5～10∶1［12］。因為任何一種單一天然油脂都不能滿足上述比例，因此必須合理調(diào)配膳食中各種食用油的比例，滿足人體對脂肪酸的營養(yǎng)需求。根據(jù)目前已報道的研究可知，國內(nèi)外學(xué)者從單一油料進(jìn)行水酶法提取技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)了單一天然油脂存在脂肪酸比例不平衡的問題，針對此問題，以大豆為主要原料、其他幾種常見植物油料為輔料，制取出了調(diào)和油滿足飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸∶多不飽和脂肪酸=0.27∶1∶1，其中n－6多不飽和脂肪酸∶n－3多不飽和脂肪酸=4～6∶1，本實驗利用前期制備的調(diào)和油對其進(jìn)行水酶法酶解工藝進(jìn)行研究，以期得到最適合的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 品種東農(nóng)46;花生 產(chǎn)自山東;亞麻籽產(chǎn)自甘肅;油茶籽 產(chǎn)自江西;Alcalase 2.4L堿性蛋白酶 丹麥novo公司。

MY146×2剖分式雙螺桿擠壓機(jī) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)自制;電子分析天平 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠;精密電動攪拌機(jī) 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;索氏抽提器 天津玻璃儀器廠;pH計上海偉業(yè)儀器廠;高速萬能粉碎機(jī) 浙江力普粉碎設(shè)備有限公司;多功能高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 每種油料的成分測定 水分的測定參照GB304－87;粗脂肪的測定參照GB5512－85中索氏抽提法;粗蛋白的測定參照GB6432－94;灰分測定參照GB5009.4－85。

1.2.2 脂肪酸測定

1.2.2.1 樣品前處理 采用氫氧化鉀－甲醇室溫醋化法。稱取油脂或脂肪酸50mg置于10mL容量瓶內(nèi)，加入3mL正己烷和苯的混合溶劑(1∶1)輕輕搖動使之溶解。再加入2mL 0.5mol/L氫氧化鉀－甲醇溶液，混勻。在室溫靜置30min，加蒸餾水使全部有機(jī)相甲酯溶液升至瓶頸上部。澄清后吸取上清液，所得上清液即可用于氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.2.2.2 分析條件 程序升溫條件:初始溫度80℃，保持5min，以10℃/min升溫至150℃，保持2min，以5℃/min升溫至230℃，保持10min，總分析時間為40min，色譜柱:HP－88(100m×0.25mm×0.20μm)，進(jìn)樣口:250℃，離子源:EI，四級桿溫度:150℃，離子源溫度:230℃，傳輸線溫度:250℃，載氣:He，進(jìn)樣模式:split，分流比:30∶1，流速:1mL/min，電離方式:EI，70eV，質(zhì)量掃描范圍:50～550amu。

1.2.3 工藝流程 混合油料→清理→粉碎→水分調(diào)節(jié)→擠壓膨化(模孔孔徑18mm、套筒溫度90℃、物料含水率14%、螺桿轉(zhuǎn)速100r/min)→粉碎→調(diào)節(jié)pH、溫度→酶解→滅酶→離心→調(diào)和油。

1.2.4 計算方法

總油提取率(%)=(大豆總含油質(zhì)量－酶解提取后殘渣含油質(zhì)量)/大豆總含油質(zhì)量×100

1.2.5 Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶制取調(diào)和油的單因素實驗

1.2.5.1 堿性蛋白酶的添加量對總油提取率的影響

在物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，酶解時間4h，酶解溫度55℃，酶解 pH9，4500r/min離心30min，分別添加1.1%、1.3%、1.5%、1.7%、1.9%、2.1%、2.3%的酶量，考察加酶量對總油提取率的影響。

1.2.5.2 酶解溫度對總油提取率的影響 在加酶量2%，物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，酶解時間4h，酶解pH為9，4500r/min離心30min條件下，酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65、70℃，考察酶解溫度對總油提取率的影響。

1.2.5.3 酶解時間對總油提取率的影響 在加酶量2%，物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，酶解溫度55℃，酶解pH為9，4500r/min離心30min條件下，酶解時間1、2、3、4、5、6、7h，考察酶解時間對總油提取率的影響。

1.2.5.4 物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總油提取率的影響 在加酶量2%，酶解溫度55℃，酶解時間4h，酶解pH為9，4500r/min離心30min條件下，物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，考察物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總油提取率的影響。

1.2.5.5 pH對總油提取率的影響 在加酶量2%，酶解溫度55℃，酶解時間4h，物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，4500r/min離心30min條件下，pH分別為7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5，考察pH對總油提取率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝參數(shù)實驗 在單因素研究的基礎(chǔ)上，選取加酶量、酶解溫度、酶解時間、料水比和酶解pH 5個因素為自變量，以總油提取率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合設(shè)計原理，設(shè)計響應(yīng)面分析實驗，其因素水平編碼表見表1。

表1 水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

2 結(jié)果與討論

2.1 每種油料比例的確定

經(jīng)過前期工作最終確定大豆、花生、亞麻籽、油茶籽的比例為4∶3.5∶1.5∶1，按此比例制取的調(diào)和油滿足飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸∶多不飽和脂肪酸= (0～1)∶1∶1，接近0.27∶1∶1，n－6多不飽和脂肪酸∶n－3多不飽和脂肪酸=4～6∶1。

2.2 Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶制取調(diào)和油的單因素實驗結(jié)果

2.2.1 堿性蛋白酶的添加量對總油提取率的影響結(jié)果見圖1，由圖1可以看出當(dāng)加酶量大于1.7%時總油提取率增加緩慢并有下降趨勢，所以在下面的響應(yīng)面實驗設(shè)計中加酶量水平選擇1.8%。

圖1 加酶量對總油提取率的影響Fig.1 Effect of dosage of enzyme on extraction rate of total oil

2.2.2 酶解溫度對總油提取率的影響 結(jié)果見圖2，由圖2可以看出酶解溫度在55℃附近總油提取率有較大值出現(xiàn)，所以在下面的響應(yīng)面實驗設(shè)計中酶解溫度選擇在55℃。

圖2 酶解溫度對總油提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of total oil

2.2.3 酶解時間對總油提取率的影響 結(jié)果見圖3，由圖3可以看出酶解時間大于2h總油提取率明顯增加，但當(dāng)酶解時間大于4h，總油提取率無明顯變化，所以在下面的響應(yīng)面實驗設(shè)計中酶解時間選擇3h。

圖3 酶解時間對總油提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction rate of total oil

2.2.4 物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總油提取率的影響 結(jié)果見圖4，由圖4可以看出物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于15%總油提取率明顯增加，但當(dāng)物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于35%，總油提取率呈下降趨勢，所以在響應(yīng)面實驗設(shè)計中物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇25%。

圖4 物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總油提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of material to water on extraction rate of total oil

2.2.5 pH對總油提取率的影響 結(jié)果見圖5，由圖5可以看出當(dāng)pH在9～10附近總油提取率存在最大值，所以在響應(yīng)面實驗設(shè)計中pH選擇9.5。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝參數(shù)對總提油率的影響結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實驗安排及實驗結(jié)果 本實驗應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行過程優(yōu)化。以X1、X2、X3、X4、X5為自變量，以總油提取率Y為響應(yīng)值，響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果見表2，實驗號1～26為析因?qū)嶒灒?7～36為10個中心實驗，用以估計實驗誤差。

圖5 酶解pH對總油提取率的影響Fig.5 Effect of pH value on extraction rate of total oil

表2 響應(yīng)面實驗方案及實驗結(jié)果Table 2 Design and result of response surface analysis

2.3.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析 通過統(tǒng)計分析軟件SAS9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型

回歸分析與方差分析結(jié)果見表3，響應(yīng)面尋優(yōu)見表4，降維分析見圖6，交互項顯著的響應(yīng)面分析見圖7。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression and variance analysis

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，模型回歸顯著(p＜0.0001)，失擬項不顯著，R2=96.65%，=92.18%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗可以得到因子貢獻(xiàn)率為:X1＞X3＞X5＞X2＞X4，即加酶量＞酶解時間＞pH＞酶解溫度＞物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

應(yīng)用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果，由表4可知當(dāng)加酶量為1.84%，溫度為50℃，酶解時間為3.3h，料水比為17.6，pH為8，響應(yīng)面最優(yōu)值為91.93%±0.5%。

表4 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果Table 4 Results of response surface optimization

圖6 各酶解參數(shù)對總油提取率的降維分析Fig.6 The enzyme solution to the total oil extraction yield of parameters reduce dimension analysis

圖7 各酶解參數(shù)交互顯著項對總油提取率的響應(yīng)面分析Fig.7 Response surface analysis of significant effective interaction items of different hydrolysis parameters on extraction rate of total oil

由圖6各酶解參數(shù)對總油提取率的降維分析可知，總油提取率隨加酶量的增加而增加，但是后期增加的趨勢不明顯，繼續(xù)增加加酶量會增加生產(chǎn)成本?？傆吞崛÷孰S酶解溫度先增大后減小，這主要因為堿性蛋白酶在一定溫度范圍內(nèi)有最佳速率，在55℃附近是酶解最佳條件?？傆吞崛÷孰S酶解時間的增加而增加，但達(dá)到一定時間后總油提取率將不再增大?？傆吞崛÷孰S物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，但達(dá)到一定值后繼續(xù)增加物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)會稀釋底物濃度，所以總油提取率減小。總油提取率隨酶解pH的增加先增加后減小，在pH為9.5附近有較大值出現(xiàn)。

由圖7分析結(jié)果可看出:X1與X2、X1與X3、X1與X4、X1與X5、X2與X3、X2與X5、X3與X5以及X4與X5的交互作用對總油提取率的影響顯著。由此可知在物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%～35%范圍內(nèi)物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總油提取率的因子貢獻(xiàn)率雖然最小，但物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其他因素的交互作用對總油提取率影響較大。

2.4 驗證實驗

在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下，即加酶量1.84%、酶解溫度50℃、酶解時間3.3h、物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.6%、酶解pH8時進(jìn)行3次平行實驗，總油提取率的平均值為91.67%。響應(yīng)值的實驗值與回歸方程預(yù)測值吻合良好，說明該模型能夠較好地預(yù)測實際調(diào)和油提取率情況。

2.5 調(diào)和油的脂肪酸分布

2.5.1 分析結(jié)果 最終制取的調(diào)和油的脂肪酸含量見表5，滿足飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸∶多不飽和脂肪酸=0.46∶1∶1，n－6多不飽和脂肪酸∶n－3多不飽和脂肪酸=4∶1，脂肪酸分布見圖8。

表5 調(diào)和油脂肪酸含量測定Table 5 Blend oil content determination of fatty acids

圖8 調(diào)和油GC－MS色譜圖Fig.8 Blend oil GC－MS chromatogram

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析方法對擠壓膨化預(yù)處理后水酶法提取調(diào)和油的酶解工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)酶解工藝條件為:加酶量1.84%、酶解溫度50℃、酶解時間3.3h、物料質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.6%、酶解pH8。經(jīng)驗證與對比實驗可知，在最優(yōu)酶解工藝條件下大豆油提取率可達(dá)到91.67%，最終制取的調(diào)和油滿足飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸∶多不飽和脂肪酸=0.46∶1∶1，n－6多不飽和脂肪酸∶n－3多不飽和脂肪酸=4∶1，符合中國人民的膳食營養(yǎng)平衡要求。

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Optimization on aqueous enzymatic extraction conditions of blending oil by response surface method

WANG Mei1，JIANG Lian－zhou1，2，*，LI Yang1，2，LIU Qi1，WANG Sheng－nan1，QI Bao－kun1
(1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;
2.National Research Centre of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

Aqueous enzymatic extraction process with extrusion pretreatment was used in this experiment to extract blending oil and the response surface method was employed to optimize the parameters in the experiment.The optimum parameters were as follows:enzyme additive amount for 1.84%，hydrolysis temperature for 50℃，hydrolysis time for 3.3h，solids－to－liquid ratio for 17.6%，pH 8.Proven experiment showed that extraction rate of blending oil could reach 91.67%.Blending oil which was extracted met the demands that the ratio of saturated fatty acids，monounsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids equals to 0.46∶1∶1，and that the ratio of n－6 polyunsaturated fatty acids and n－3 polyunsaturated fatty acids equals to 4∶1.

response surface method;extrusion;blending oil

TS224

B

1002－0306(2012)21－0218－05

2012－04－23 *通訊聯(lián)系人

王梅(1987－)，女，在讀碩士，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程。

黑龍江省攻關(guān)項目(GA09B401－6);農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(nycytx－004)。