響應面法優(yōu)化竹葉黃酮萃取工藝及其抗氧化研究

姚 曦，岳永德，湯 鋒

(國際竹藤中心，北京 100102)

響應面法優(yōu)化竹葉黃酮萃取工藝及其抗氧化研究

姚 曦，岳永德，湯 鋒

(國際竹藤中心，北京 100102)

利用微波提取慈竹葉中總黃酮類化合物。在單因素實驗的基礎上，采用響應面法研究微波提取的最佳工藝條件。結果表明，以80%的乙醇為提取溶劑，微波提取最佳條件為:提取溫度70℃、提取時間10.5min、液固比為34∶1mL/g;在此工藝條件下，慈竹葉總黃酮得率為1.381%。抗氧化活性研究表明，慈竹竹葉總黃酮DPPH·清除作用較好，其IC50值為141.5mg/L，優(yōu)于相同濃度的2，6－二叔丁基對甲酚(BHT)。

竹葉，總黃酮，微波輔助提取，響應面法，抗氧化活性

竹子屬于單子葉植物(Monocotyledoneae)中的禾本目 (Graminales)禾本 科 (Poaceae)竹 亞科(Bambusoideae)，在我國有著悠久的藥用歷史。《本草綱目》記載:“淡竹葉氣味辛平，大寒，無毒;主治:心煩、尿赤、小便不利等。苦竹葉氣味苦冷、無毒;主治口瘡、目痛、失眠、中風等”。近些年來研究［1］表明竹葉中含有黃酮類化合物，因其具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎抑菌、降低膽固醇等多種藥理活性，其藥用價值日益被人們所重視。微波輔助萃取(MAE)是近年來發(fā)展較快的新型提取方法，具有高效性、提取時間短、能耗低、節(jié)約溶劑等特點，在國內外已被廣泛應用于食品、環(huán)境、天然活性成分等提取［2－4］。很多文獻報道了應用微波萃取植物中的總黃酮成分，如對葛根［5］、山楂葉［6］、滿山紅葉［7］、黨參［8］等的總黃酮的萃取。近年來，不少學者對竹葉中黃酮類物質的提取技術進行了多方面積極和有益的探索，但主要集中在對傳統(tǒng)提取方法的優(yōu)化改良上［9－11］，有關微波輔助提取的文獻報道少見。本實驗運用響應面分析法(Response Surface Analysis，RSA)，并采用Box－Benhnken Design的中心組合實驗設計［12－13］，對提取條件進行優(yōu)化，對擬合數(shù)學模型進行描述，篩選出微波提取竹葉總黃酮的最佳工藝條件，同時對慈竹竹葉總黃酮的抗氧化活性進行評價，旨在為竹資源的綜合利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

慈竹(Neosinocalamus affinins)竹葉 采自四川綿竹，自然陰干后再于60℃烘干至恒重后，于高速粉碎機粉碎，取過60目篩的竹粉于干燥器內備用。

微波消解儀 美國CEM公司MARS－5型;紫外－可見分光光度計 美國PE公司6400型。

1.2 實驗方法1.2.1 標準曲線的建立［14］精確稱取于120℃干燥至恒重的蘆丁對照品0.01g，用80%乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，配制成0.1g/L的蘆丁對照品溶液。準確移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的蘆丁對照品溶液于10mL容量瓶中，用乙醇補充至5.0mL;加入0.1mol/L氯化鋁溶液4mL，最后用30%乙醇補充至刻度，搖勻后放置15min;以相應試劑做空白，于406nm處測定吸光度，制作蘆丁標準曲線。

1.2.2 竹葉黃酮的提取及含量測定 準確稱取竹葉樣品0.60g，置于微波提取罐中，按一定液固比加入溶劑。分別按實驗設計的條件進行萃取，儀器設定為控溫模式，微波功率為600W［15－17］。反應后冷卻至室溫取出，過濾，定容到25mL容量瓶中，取待測液1.0mL，置于10mL容量瓶中，用溶劑補充到5.0mL，按照測定蘆丁標準溶液吸光度的方法測定其吸光度A。

1.2.3 竹葉黃酮得率計算 根據(jù)標準曲線，由吸光度A計算出黃酮質量濃度c，竹葉總黃酮得率Y/(mg·g－1)則由下式計算:

式中:c為黃酮質量濃度，mg/mL;10為10倍;25為mL;m為竹葉質量，g。

1.2.4 響應面法優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎上，以提取時間、提取溫度、液固比等因素為考察變量，以總黃酮得率Y為響應值，應用Design－Expert 8.05軟件，優(yōu)化微波提取竹葉總黃酮的工藝條件。實驗因素與水平設計見表1。

表1 Box－Behnken設計實驗因素水平Table 1 Coded levels of variables of the central composite experimental design(CCD)

1.2.5 竹葉黃酮抗氧化實驗 將待測抗氧化劑配制成系列溶液，測定各濃度抗氧化劑對DPPH自由基清除率，在清除率20%～80%的范圍內，繪制清除率對濃度曲線，計算出清除率為50%時的濃度值，即為IC50值。

2 結果與分析

2.1 線性回歸方程

根據(jù)各濃度蘆丁對應的吸光度，計算得到線性回歸:A=32.3c－0.0228，相關系數(shù)R=0.9998。

2.2 單因素實驗

黃酮類化合物宜溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機溶劑中。乙醇無毒，對天然藥物細胞有較強的穿透能力，對許多成分溶解性能好且能抑制酶的催化作用，所以本研究采用80%乙醇為提取溶劑。

2.2.1 提取溫度對總黃酮得率的影響 在乙醇濃度為80%，液固比為30mL/g，提取時間為10min的條件下，考察不同提取溫度對總黃酮得率的影響，結果如圖1所示。

圖1 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction ratio

由圖1可以看出，隨著溫度的升高，提取率隨之增加，當溫度達到70℃后，繼續(xù)升溫，提取率略有下降，這可能和黃酮類化合物熱穩(wěn)定性有關，且過高溫度下提取物中的活性成分容易被破壞，雜質溶出量增加，給后續(xù)操作帶來不便，成本增大。

2.2.2 提取時間對總黃酮得率的影響 在液固比為30mL/g，提取溫度為70℃的條件下，考察微波提取時間對總黃酮得率的影響。由圖2可以看出，微波提取時間在6～10min范圍內，隨著提取時間的增加，總黃酮得率逐漸增加;若進一步增加提取時間，總黃酮得率則有所降低。這說明提取時間過短，黃酮類物質還未充分溶出，而時間過長，一些熱敏性組分被破壞或部分溶劑揮發(fā)導致乙醇濃度降低而使黃酮類化合物提取率降低［18］。

圖2 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction ratio

2.2.3 液固比對竹葉總黃酮得率的影響 在提取溫度為70℃，提取時間為10min的條件下，考察液固比對總黃酮得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 液固比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid－to－solid on extraction ratio

由圖3可看出，隨著液固比的增加，總黃酮得率呈現(xiàn)出由低到高，并趨于穩(wěn)定的趨勢。一方面溶劑用量的增加可以增大樣品與溶劑的接觸面，有利于擴散速度的提高;另一方面，當液固比達到一定的比例時，黃酮已經基本提取完全，不再溶出。

表3 黃酮提取參數(shù)數(shù)學回歸分析結果Table 3 Results of regression analysis of extraction factors for Flavoniods extraction

2.3 響應面法對慈竹總黃酮微波提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

實驗分析方案及結果見表2。

表2 實驗方案與結果Table 2 Design and results of tests

將所得實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到竹葉黃酮得率Y與微波提取各因素變量的二次回歸方程模型為:

為了檢驗方程的有效性，對微波提取慈竹總黃酮的數(shù)學模型進行方差分析，并對各因子的偏回歸系數(shù)進行檢驗，結果見表3。此模型的決定系數(shù)R2為0.9976，線性關系極顯著;一次項中X2、X3的回歸系數(shù)極顯著，說明提取時間和液固比對總黃酮得率有極顯著影響，與X1相關顯著，即提取溫度對響應值有顯著影響;交互項X1X2和X1X3的偏回歸系數(shù)極顯著，說明提取溫度和提取時間、提取溫度和液固比的交互項對總黃酮的得率有極顯著影響;二次項中X12、X22、X3

2的偏回歸系數(shù)達到極顯著水平。回歸方差分析顯著性檢驗結果表明，該模型回歸極顯著，且失擬項不顯著(p=0.058＞0.05)，說明該方程對實驗擬合較好。將表2中的實驗數(shù)據(jù)對此方程所代表的面進行分析，可以推測出優(yōu)化條件在實驗中所覆蓋的區(qū)域，或是指明在哪些方向上再進行實驗可得到更好的結果。

根據(jù)回歸方程做出響應面，考察擬合響應曲面的形狀，分析提取溫度、提取時間和液固比對黃酮總得率的影響，結果見圖4～圖5。由圖4可以看出，一定范圍內，總黃酮得率隨提取溫度和提取時間的增加而提高，兩者交互作用顯著。根據(jù)動力學理論，時間的延長有利于黃酮的充分擴散析出，同時微波功率的提高使得分子解附和擴散運動速率加快，從而增加了黃酮的析出速率及其得率。因此，適當增加提取溫度和提取時間有助于提高總黃酮的得率。

圖4 Y=f(x1，x2)響應面立體圖Fig.4 Response curved surface figure of Y=f(x1，x2)

由圖5可知，在一定范圍內，總黃酮得率隨提取溫度和液固比的增加呈上升趨勢。液固比的增加能增大液－固兩相黃酮的濃度梯度，從而提高黃酮溶出的速率及其得率。但溶劑量太大會造成溶劑回收耗時較長，能耗高以及資源浪費。

2.4 提取工藝條件的確定及可靠性驗證

圖5 Y=f(x1，x3)響應面立體圖Fig.5 Response curved surface figure of Y=f(x1，x3)

在模型取值范圍內選擇最低點為出發(fā)點，依模型使用快速上升法進行優(yōu)化，可得微波提取總黃酮的最佳理論工藝條件為:提取溫度70.28℃，提取時間10.35min，液固比33.85mL/g，此條件下竹葉總黃酮得率為1.372%。

為檢驗響應曲面法的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行實驗，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為提取溫度70℃，提取時間10.5min，液料比34∶1(mL/g)，實際測得的總黃酮平均得率為1.381%，與預測值基本一致。因此，采用RSA法優(yōu)化得到的提取條件準確可靠，具有實用價值。

2.5 竹材提取物抗氧化實驗效果

最優(yōu)條件下萃取慈竹黃酮提取物和兩種陽性對照溶液的50%清除率的濃度見表4。

表4 慈竹樣品抗氧化測定IC50值Table 4 IC50values of sample

由表4可知，慈竹總黃酮提取物表現(xiàn)出較好的抗氧化效果，其IC50值為141.5mg/L，抗氧化效果弱于TBHQ，同時是合成抗氧化劑BHT清除超氧離子能力1.79倍，表現(xiàn)出很較強的抗氧化活性水平。

3 結論

本研究在單因素實驗的基礎上，采用RSA法優(yōu)化了微波提取慈竹葉總黃酮的工藝參數(shù)，建立了回歸模型方程，該模型回歸極顯著，且失擬項不顯著，說明該方程對實驗擬合較好。根據(jù)優(yōu)化提取條件進行驗證實驗，在乙醇濃度為80%，提取溫度70℃，提取時間為10.5min，液固比為34∶1(mL/g)的條件下，慈竹葉中的總黃酮提取率為1.381%。采用響應面法優(yōu)化的總黃酮微波輔助提取工藝條件對竹葉黃酮的綜合利用以及黃酮類化合物的產業(yè)化具有理論指導意義。萃取得到的竹葉黃酮具有較好的抗氧化能力，可作為一種理想天然抗氧化劑的提取原料，本研究也為竹資源的高附加值利用提供一定的參考依據(jù)。

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Study on optimization of extraction of falconoid from bamboo leaves by response surface analysis and its antioxidant activity

YAO Xi，YUE Yong－de，TANG Feng
(International Centre for Bamboo and Rattan，Beijing 100102，China)

The extraction of total flavoniods fromNeosinocalamus affininsleaves by microwave－assisted extraction was carried out，and the optimal extraction conditions was studied，such as extraction temperature，extraction time and liquid－to－solid ratio，by response surface analysis(RSA)based on single factor tests.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows in the presence of 80%ethanol as solvent，extraction temperature 70℃，extraction time 10.5minutes and liquid－to－solid ratio 34mL/g.Under the optimal conditions，the yield of total flavoniods fromNeosinocalamus affininsleaves reached 1.381%.Antioxidant activities were evaluated by using 1，1－dipheny－l2－picrylhydrazyl(DPPH)radical in vitro.The IC50was 141.5mg/L，and the result showed that the DPPH radical scavenging activity of flavonoids was stronger that of DPPH.

bamboo leaf;total flavoniods;microwave－assisted extraction(MAE);response surface analysis (RSA);antioxidant

TS201.2

B

1002－0306(2012)21－0223－04

2012－03－15

姚曦(1981－)，男，博士生，助理研究員，研究方向:植物化學、食品分析。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(20100400708);國際竹藤中心基本科研業(yè)務費項目(1632010009)。