玉米麩皮水溶性多糖除蛋白條件研究

楊國力，王文俠，張慧君，孫曉慧

(齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院，齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006)

玉米麩皮水溶性多糖除蛋白條件研究

楊國力，王文俠*，張慧君，孫曉慧

(齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院，齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006)

采用TCA法、Sevag法、酶法、酶法－TCA法結(jié)合和酶法－Sevag法結(jié)合對玉米麩皮水溶性多糖進行除蛋白研究，以蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率為指標(biāo)。結(jié)果表明:酶法－TCA法結(jié)合除蛋白最佳條件為:酶解溫度55℃，酶解時間1.5h，pH7.5，加酶量2%(以底物計)，TCA終濃度為1%，其蛋白質(zhì)脫除率為95.24%，多糖損失率為20.02%，優(yōu)于其他四種方法。此方法可用于玉米麩皮水溶性多糖中蛋白質(zhì)的去除。

玉米麩皮，水溶性多糖，蛋白質(zhì)

玉米麩皮是玉米淀粉濕法加工的副產(chǎn)物，其含有豐富的粗纖維、淀粉、蛋白質(zhì)、粗脂肪和少量的灰分及酚類化合物［1］。長期以來，玉米麩皮除生產(chǎn)玉米油和用作動物飼料以外，很少體現(xiàn)出商業(yè)價值。玉米麩皮水溶性多糖作為非淀粉多糖，具有明顯的減肥、降血糖和抗便秘等重要的生理功能［2－4］，在功能食品和臨床醫(yī)學(xué)等方面都有重要的應(yīng)用價值。但是在提取過程中多糖產(chǎn)品常含有一定的蛋白質(zhì)，對其分離純化、結(jié)構(gòu)表征和生理活性的研究都有一定影響，因此，如何有效地去除玉米麩皮水溶性多糖中的蛋白質(zhì)，并且提高其生理活性和經(jīng)濟價值是整個課題研究中的重要步驟。目前，除蛋白的方法主要有經(jīng)典的Sevag法、TCA法、三氯乙酸－正丁醇法、三氯三氟乙烷與Sevag聯(lián)用法、大孔吸附樹脂法、等電點沉淀法、酶解法及綜合法等。其中，Sevag法［5］是利用有機溶劑使蛋白質(zhì)變性成不溶狀態(tài)而分離出去，但其試劑消耗量大，操作復(fù)雜，費時，因此，在工業(yè)應(yīng)用上受到限制;TCA法［6］則是使蛋白質(zhì)帶正電荷并與負離子結(jié)合呈不溶性的鹽類而分離出去，但其反應(yīng)劇烈，濃度過高時，可能會引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞;酶法是在蛋白酶的作用下使蛋白質(zhì)分解成為小肽，醇沉?xí)r小肽不能隨多糖一起沉降。本研究采用TCA法、Sevag法、酶法、酶法－TCA法結(jié)合和酶法－Sevag法結(jié)合對玉米麩皮水溶性多糖進行除蛋白，對比這幾種方法對粗多糖液的蛋白脫除率和多糖損失率的效果，以此篩選出最佳的除蛋白工藝，對接下來的分離純化、結(jié)構(gòu)表征和生理活性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

玉米麩皮 黑龍江省鏡泊湖農(nóng)業(yè)開發(fā)股份有限公司;耐高溫α－淀粉酶(120KUN/g)、堿性蛋白酶(2.4AU/g)、中性蛋白酶(0.8AU/g) 諾維信公司;無水乙醇、氯仿、正丁醇、酒石酸鉀鈉 天津市凱通試劑有限公司;無水碳酸鈉 西安化學(xué)試劑廠;硫酸銅

天津市巨能化學(xué)有限公司;氫氧化鈉、三氯乙酸、葡萄糖 均購自天津市科密歐試劑開發(fā)中心;濃硫酸 沈陽市華東試劑廠。

LG10－2.4A高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠; 722S可見分光亮度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;101－2－BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SHZ－C水浴恒溫振蕩器 上海躍進醫(yī)療器械廠;DZKW－S－4電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;BS124S分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;ACS－30型電子計價器 永康市風(fēng)華衡器有限公司;CEIP503中空纖維膜組件 天津膜天膜工程技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米麩皮水溶性多糖的提取［7］玉米麩皮經(jīng)過CO2超臨界脫脂后，過40目篩，稱取150g脫脂玉米麩皮，按照料液比1∶40添加蒸餾水，混合均勻后，置于沸水浴中糊化30min，調(diào)pH為6，加入5%耐高溫α－淀粉酶(以底物計)，在95℃恒溫攪拌2h，冷卻至常溫，調(diào)pH8，加入5%堿性蛋白酶(以底物計)，55℃恒溫攪拌2h。過濾，所得濾液經(jīng)過10000u的中空纖維膜超濾，所得截留液即為玉米麩皮水溶性粗多糖溶液。

1.2.2 多糖含量測定 采用苯酚—濃硫酸比色法［8］測定樣品中的多糖含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y= 0.0118x+0.0178，相關(guān)系數(shù)R2=0.9944。

1.2.3 多糖損失率計算

式中:A0為初始樣品中多糖含量;A1為經(jīng)過除蛋白處理后樣品中多糖的含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測定 采用Folin－酚法［8］測定樣品中的蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0019x+ 0.007，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

1.2.5 蛋白脫除率計算

式中:C0為初始樣品中蛋白質(zhì)的含量;C1為經(jīng)過除蛋白處理后樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.3 除蛋白方法

1.3.1 TCA法［5］除蛋白 各取玉米麩皮水溶性粗多糖濃縮液5mL，以1∶1的體積加入三氯乙酸溶液，使其最終濃度分別為0.25%、0.5%、1%、2%、3%、4%、6%，混合均勻后，靜置30min，5000r/min離心10min去除沉淀，測定上清液中多糖和蛋白質(zhì)的含量，并計算多糖損失率和蛋白脫除率。

1.3.2 Sevag法［6］除蛋白 取玉米麩皮水溶性粗多糖濃縮液 30mL，加入 0.5倍體積的 Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)，用搖床劇烈振搖20min，5000r/min離心10min去除中間變性蛋白質(zhì)和下層的有機試劑，留取5mL上清液，剩余上清液重復(fù)2次上述步驟，分別測定四次上清液中多糖和蛋白質(zhì)的含量，并計算多糖損失率和蛋白脫除率。

1.3.3 酶法［9］除蛋白 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選擇加酶量，酶解溫度，酶解時間和pH四因素，各自選取三個水平，以蛋白質(zhì)含量為檢測指標(biāo)，做L9(34)正交實驗。因素水平表如表1所示。

1.3.4 酶法－TCA法［10］結(jié)合除蛋白 按照1.3.3優(yōu)化出酶解除蛋白的最佳條件對粗多糖液進行處理，之后再按照1.3.1確定的最佳TCA法條件對酶解液處理，分別計算多糖損失率和蛋白脫除率。

表1 酶解法除蛋白質(zhì)實驗因素水平表Table 1 Factor level of protein removal with the enzyme

1.3.5 酶法－Sevag法［11］結(jié)合除蛋白 按照1.3.3優(yōu)化出酶解除蛋白的最佳條件對粗多糖液進行處理，之后再按照1.3.2確定的最佳Sevag法條件對酶解液處理，分別計算多糖損失率和蛋脫除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCA法除蛋白

三氯乙酸作為有機酸溶劑，可以使樣品中的蛋白質(zhì)帶上正電荷與負離子結(jié)合形成不溶性鹽類，使蛋白質(zhì)變性沉淀出來，由于其反應(yīng)劇烈，當(dāng)濃度過高時可能會引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞，因此綜合考慮要使其最終濃度低于7%左右［12］。由圖1可以看出，在TCA終濃度為0.25%～2%的范圍內(nèi)，隨著TCA終濃度的增大，蛋白質(zhì)脫除率呈先增大后降低的趨勢，但是趨勢較緩，多糖損失率是先降低后增大，變化趨勢較劇烈;在TCA終濃度為2%～6%的范圍內(nèi)，隨著TCA終濃度的增大，蛋白質(zhì)脫除率先增大后趨于平緩，多糖損失率急劇下降直至平緩，單因素方差分析結(jié)果表明，TCA終濃度對蛋白脫除率和多糖損失率都高度顯著影響(p＜0.05)，并通過比較各水平下的實驗數(shù)據(jù)平均值，可確定蛋白脫除率最高和多糖損失率最低時，TCA終濃度分別為3%和1%。綜合考察，確定TCA終濃度為1%，此時，多糖損失率最低，蛋白脫除率為62.85%。

圖1 TCA法脫蛋白的效果Fig.1 The effect of protein removal with the TCA

2.2 Sevag法除蛋白

Sevag法是經(jīng)典的除蛋白方法，利用有機溶劑使蛋白質(zhì)變性成不溶狀態(tài)而分離出來［13］。由圖2可以看出，隨著Sevag試劑處理的次數(shù)增加，蛋白質(zhì)脫除率不斷增加，多糖損失率也是隨著處理次數(shù)增加而增大，其增大的趨勢大于蛋白質(zhì)脫除率的趨勢。在處理第3次時，離心后發(fā)現(xiàn)試管中已沒有中間變性蛋白層，但是多糖損失率卻增大了很多。方差分析結(jié)果表明，Sevag試劑處理次數(shù)對蛋白脫除率和多糖損失率都高度顯著影響(p＜0.05)，并通過比較各水平下的實驗數(shù)據(jù)平均值，可確定蛋白脫除率最高和多糖損失率最低時，Sevag試劑處理次數(shù)分別為3次和1次。考慮到多糖除蛋白的前提是在較少損失多糖的情況下盡可能多的除去蛋白質(zhì)，三次處理，蛋白質(zhì)脫除率增加已不太明顯，因此，選擇Sevag試劑作用一次，其蛋白脫除率達 57.60%，多糖損失率為3.28%。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

圖2 Sevag法脫蛋白的效果Fig.2 The effect of protein removal with Sevag method

2.3 酶法除蛋白

酶法除蛋白是利用蛋白酶降解多糖中的蛋白質(zhì)使其分解成小肽，處于較好的水溶性狀態(tài)，通過醇沉從而與多糖分離開來。按照表1進行正交實驗，結(jié)果如表2所示。

表2 酶解除蛋白實驗正交結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test on protein removal by enzyme

從表2極差分析結(jié)果可知，各因素作用的主次順序是C＞A＞D＞B，由k值大小可知，最佳組合是A2B2C1D1。方差分析結(jié)果如表3所示，因素A、B、C、D極顯著。因素作用的主次順序C＞A＞D＞B，與極差分析結(jié)果一致。由于最優(yōu)組合A2B2C1D1未出現(xiàn)在正交表中，所以對該組合進行重復(fù)三次的驗證實驗，結(jié)果顯示:蛋白脫除率為87.4%。所得到的蛋白脫除率比正交表中的都高，說明正交實驗所確定的條件是合適的，因此確定酶法脫除玉米麩皮水溶性多糖中蛋白質(zhì)的最佳條件是:酶解溫度55℃，酶解時間1.5h，pH7.5，加酶量2%。

2.4 酶法-TCA法，酶法-Sevag法結(jié)合除蛋白

酶法除蛋白條件比較溫和，操作簡便，但是除蛋白不夠徹底，常與其他化學(xué)除蛋白法結(jié)合，通過協(xié)同作用，通常能夠徹底脫除玉米麩皮水溶性多糖中的蛋白質(zhì)。分別用酶法－TCA法結(jié)合和酶法－Sevag法結(jié)合處理玉米麩皮水溶性多糖，結(jié)果如表4所示，對于蛋白脫除率的效果要遠遠高于酶法－Sevag法結(jié)合，但是酶法－TCA法結(jié)合的多糖損失率要高一些，綜合考慮，酶法－TCA法結(jié)合除蛋白效果要好于酶法－Sevag法結(jié)合，蛋白脫除率高達95.24%。

表4 酶法－TCA法和酶法－Sevag法脫除蛋白的效果Table 4 Effect of protein removal methods with enzyme－TCA and enzyme－Sevag

2.5 綜合分析

從圖3可知，單獨使用TCA法，蛋白脫除率為62.85%，多糖損失率為23.01%，而使用酶法－TCA法結(jié)合的方法，蛋白質(zhì)脫除率達到95.24%，遠遠高于前者，多糖損失率為20.02%，略低于前者;單獨使用Sevag法，蛋白脫除率為 57.60%，多糖損失率為3.28%，而使用酶法－Sevag法結(jié)合的方法，蛋白質(zhì)脫除率達到73.32%，高于前者，多糖損失率為10.09%。通過對比以上不同除蛋白方法和結(jié)合圖3可知，單獨使用 TCA法、Sevag法除蛋白，效果沒有用酶法－TCA法，酶法－Sevag法結(jié)合除蛋白的效果好，而酶法－TCA法與酶法－Sevag法相比較，酶法－TCA法效果更佳。

3 結(jié)論

圖3 幾種除蛋白方法效果的比較Fig.3 Comparison of several protein removal methods

本文對5種除蛋白的方法做了對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶法－TCA法結(jié)合更優(yōu)于酶法－Sevag法結(jié)合、單一的TCA法、Sevag法和酶法。最終確定酶法－TCA法結(jié)合去除玉米麩皮水溶性多糖最佳條件為:先用2%(以底物計)的堿性蛋白酶在55℃，pH為7.5的條件下作用1.5h，再在酶解液中加入等體積的TCA溶液，使其終濃度為1%，靜置30min后，其蛋白質(zhì)脫除率達95.24%，糖損失率為20.02%。

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Removal of protein from water solvable polysaccharide of corn bran

YANG Guo－li，WANG Wen－xia*，ZHANG Hui－jun，SUN Xiao－h(huán)ui
(College of Food Science and Engineering，Qiqihar University，Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province，Qiqihar 161006，China)

Trichloroacetic acid(TCA)，Sevag，enzymatic hydrolysis，the combination of enzyme and Sevag，and the combination of enzyme and TCA were used to remove protein from water solvable polysaccharide of corn bran.These methods based on deproteinization rate and recovery rate of the polysaccharide.The results showed that the optimal conditions of the combination of enzyme and TCA were 55℃，pH7.5 and 1.5h，enzyme concentration of 2.0%(base substrate)，TCA final concentration of 1%.Under the optimal conditions，the deproteinization rate and the recovery rate of polysaccharide was 95.24%and 20.02%，respectively.The combining enzyme and TCA could largely improve the removal of protein.

corn bran;water solvable polysaccharide;protein

TS241

B

1002－0306(2012)21－0239－04

2012－06－27 *通訊聯(lián)系人

楊國力(1987－)，碩士，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品深加工。

黑龍江省自然科學(xué)基金項目(B201115);齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目(YJSCX2001－042X)。