醇 水交換法提取樺褐孔菌生物活性物質(zhì)的工藝研究

馬微微，陳文華，王新紅，萬雪蓮，王德才

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086)

醇 水交換法提取樺褐孔菌生物活性物質(zhì)的工藝研究

馬微微，陳文華，王新紅，萬雪蓮，王德才*

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086)

目的:利用超聲熱學(xué)及空化技術(shù)，研究醇－水交換提取樺褐孔菌中的三萜類和多糖生物活性物質(zhì)的最佳提取工藝。方法:樺褐孔菌粉碎，過30目篩，超聲輔助醇－水交換提取其生物活性物質(zhì)。結(jié)果:醇提三萜類物質(zhì)最佳工藝為:溫度30℃，時(shí)間50min，提取3次，液料比25∶1，得率為1.30%;水提多糖最佳工藝為:溫度50℃，時(shí)間40min，提取3次，液料比35∶1，得率為6.96%。結(jié)論:超聲輔助醇－水交換提取樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)的最佳提取工藝穩(wěn)定、合理可行，能有效提高樺褐孔菌的綜合利用。

樺褐孔菌，醇－水交換，超聲

樺褐孔菌是一種生長在寒帶的木腐菌，主要寄生于白樺樹、銀樺、赤楊等的樹干或樹皮下。在我國主要生長在吉林、黑龍江、西藏、青海等高海拔山區(qū)的樺屬樹木上［1］。隨著對(duì)樺褐孔菌化學(xué)成分研究的不斷深入，大量的活性物質(zhì)被分離出來，目前已報(bào)道的除在水提取物中提取出的多糖外還含有醇提取物三萜類、樺褐孔菌醇和栓菌酸等200多種化學(xué)成分。作為樺褐孔菌的主要活性成分，三萜類物質(zhì)和多糖可用于抗腫瘤、抗艾滋病毒、治療糖尿病［2］、抗衰老［3］、降血壓、調(diào)節(jié)血脂［4］等。目前對(duì)樺褐孔菌三萜類物質(zhì)和多糖的綜合提取工藝尚很少報(bào)道，本文利用超聲熱學(xué)空化技術(shù)，研究醇、水交換提取樺褐孔菌中的兩種生物活性物質(zhì)三萜類及多糖物質(zhì)的最佳提取工藝，充分利用樺褐孔菌資源，為促進(jìn)樺褐孔菌的開發(fā)和綜合利用提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌粉 產(chǎn)自伊春市五營區(qū)，40℃條件下烘干、粉碎、過30目篩;無水乙醇 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，分析純。

KQ－100DB超聲波譜儀 昆山市超聲儀器有限公司;FW80粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司; RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TD4A離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司;HPD－25A真空負(fù)壓過濾器 上海昨非實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司; DZF－6030B真空干燥箱、HWS24電熱恒溫水浴鍋

上海一恒科技有限公司;30目土樣分析篩 南京土壤儀器廠;UV－VIS8500紫外－可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn) 樺褐孔菌清選去雜，40℃條件下烘干、粉碎、過30目篩，取10.0g樺褐孔菌粉樣品，置于乙醇真空回流提取濃縮罐中，以液料比25∶1，30℃提取三次(50min/次)，收集醇提液，過濾，真空減壓濃縮，乙醇回收，濃縮液真空干燥，得三萜類物質(zhì);殘?jiān)匆毫媳?5∶1的比例加入蒸餾水，50℃提取三次(40min/次)，合并提取液，過濾，真空減壓濃縮，濃縮液醇沉12h，離心收集沉淀真空干燥，得多糖。

1.2.3 樺褐孔菌三萜類物質(zhì)、多糖含量的測(cè)定 三萜類物質(zhì):香草醛比色法［5－6］;多糖:苯酚—硫酸法［7］。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 本研究采用醇－水交換法提取樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)。按1.2.1的提取工藝，以得率為指標(biāo)，主要考察提取方法、溫度、時(shí)間、提取次數(shù)和液料比對(duì)三萜類物質(zhì)和多糖得率的影響。

1.2.5.1 提取方法對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:溫度為40℃，液料比20∶1，溶劑為無水乙醇，超聲波功率為100W，采用溶液浸提法與超聲輔助提取法，分別提取20、40、60min，提取三次。

多糖的提取:溫度為50℃，液料比20∶1，溶劑為蒸餾水，超聲波功率為100W，采用溶液浸提法與超聲輔助提取法，分別提取30、40、50min，提取三次。

1.2.5.2 提取溫度對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:固定提取時(shí)間為40min，液料比20∶1，超聲波功率為100W，分別在溫度為20、30、40、50℃中提取，測(cè)得率。

多糖的提取:固定提取時(shí)間為40min，液料比20∶1，超聲波功率為100W，分別在溫度為40、50、60、70、80℃中提取，測(cè)得率。

1.2.5.3 提取時(shí)間對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:固定提取溫度為40℃，液料比20∶1，超聲波功率為100W，分別在時(shí)間為20、30、50、60min時(shí)提取，測(cè)得率。

多糖的提取:固定提取溫度為 50℃，液料比20∶1，超聲波功率為100W，分別在時(shí)間為30、40、50、60min時(shí)提取，測(cè)得率。

1.2.5.4 提取次數(shù)對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:固定提取溫度為40℃，液料比20∶1，超聲波功率為100W，提取時(shí)間為40min，分別提取四次，測(cè)得率。

多糖的提取:固定提取溫度為 50℃，液料比40∶1，超聲波功率為100W，提取時(shí)間為40min，分別提取四次，測(cè)得率。

1.2.5.5 液料比對(duì)得率的影響 三萜類物質(zhì)的提取:固定提取溫度為40℃，提取時(shí)間為40min，超聲波功率為100W，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，測(cè)得率。

多糖的提取:固定提取溫度為50℃，提取時(shí)間為50min，超聲波功率為100W，液料比分別為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，測(cè)得率。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、液料比四種單因素考察的基礎(chǔ)上，選用正交表L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1、表2。

表1 醇提因素與水平L9(34)Table 1 Factors and levels on alcohol extraction conditions

表2 水提因素與水平L9(34)Table 2 Factors and levels on water extraction conditions

1.2.7 醇析濃度對(duì)多糖得率的影響 取等體積的水提液5份，每份100mL，分別加入100、200、300、400、500mL的無水乙醇，靜置12h后，離心收集沉淀，烘干稱重，并記錄。

1.2.8 醇沉溫度對(duì)多糖得率的影響 乙醇沉淀法提取多糖時(shí)，醇沉的溫度是影響多糖得率的重要因素，本實(shí)驗(yàn)采用不同溫度(4、25℃)來沉淀多糖，測(cè)多糖得率。

2 結(jié)果與討論

2.1 三萜類物質(zhì)含量測(cè)定

以吸收度(y)對(duì)齊墩果酸含量(x)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0027x，r2=0.998。

2.2 多糖含量測(cè)定

以吸收度(y)對(duì)葡萄糖含量(x)進(jìn)行回歸，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.3596x－0.0143，r2=0.995。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 提取方法對(duì)得率的影響 超聲波提取技術(shù)［8］是利用超聲波特殊的強(qiáng)縱向振動(dòng)，高速?zèng)_擊破碎，產(chǎn)生空化效應(yīng)，以達(dá)到攪拌及加熱等物理性能。破壞提取物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使溶媒能滲入細(xì)胞內(nèi)部，從而加速有效成分的溶解，提高有效成分的提出率，實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析證明超聲波提取可大大縮短提取時(shí)間，提高提取率，并且不改變有效成分的結(jié)構(gòu)［9］。由圖1可見，在提取三萜類物質(zhì)和多糖中，在同一時(shí)間點(diǎn)采用超聲波輔助法的提取率均高于傳統(tǒng)水浴法，具有省時(shí)、高效、節(jié)能、易操作等優(yōu)點(diǎn);溫度高時(shí)會(huì)有部分提取物分解，而超聲波提取能在低溫條件下保證提取物的得率。因此，超聲輔助法優(yōu)于傳統(tǒng)水浴提取。

圖1 提取方法對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of methods on extraction yield

2.3.2 溫度對(duì)得率的影響 由圖2可見，超聲波輔助方法提取溫度低時(shí)溶出物少，有效成分含量低;隨著溫度增加，細(xì)胞膜破碎程度增強(qiáng)，溶出物增多，同時(shí)溫度增加可以加快溶劑的運(yùn)動(dòng)速度，減少溶質(zhì)在固體表面的吸附作用，使細(xì)胞中活性物質(zhì)迅速進(jìn)入到溶劑中，得率也就增高。但值得注意的是:溫度過高對(duì)溶解物破壞的可能性大。三萜類物質(zhì)在40℃時(shí)得率最高，達(dá)到1.30%;多糖在50℃時(shí)得率最高，達(dá)到6.87%。

圖2 溫度對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction yield

2.3.3 時(shí)間對(duì)得率的影響 提取時(shí)間決定著生產(chǎn)的周期，是生產(chǎn)工藝研究中的一個(gè)十分重要的影響因素，它決定著生產(chǎn)成本和能源的消耗。由圖3可見，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，得率隨時(shí)間的增加而增加。這是由于超聲時(shí)間較短時(shí)，溶出物較少，提取物含量較低;隨著時(shí)間增加，細(xì)胞膜破碎程度增強(qiáng)，溶出物增多，得率隨之增高。三萜類物質(zhì)、多糖分別在50、40min時(shí)得率最高，分別為1.3%、6.87%。當(dāng)時(shí)間過長有效成分已經(jīng)完全溶出，細(xì)胞壁進(jìn)一步破碎，溶解雜質(zhì)相應(yīng)增加，得率反而降低，違背了縮短工時(shí)，減少能耗的原則。

2.3.4 提取次數(shù)對(duì)得率的影響 由圖4可知:得率是隨著提取次數(shù)的增加而增加的。在提取三萜類物質(zhì)和多糖實(shí)驗(yàn)中，提取三次均比提取兩次更為明顯的增加，而提取四次較三次而言略微改變。考慮到費(fèi)時(shí)因素，避免浪費(fèi)能源，增加濃縮工序的難度，選擇提取三次作為最佳提取次數(shù)。

圖3 時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield

圖4 次數(shù)對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of times on extraction yield

2.3.5 液料比對(duì)得率的影響 由圖5可見，當(dāng)乙醇提取三萜類物質(zhì)，液料比在10∶1～20∶1時(shí)，三萜類物質(zhì)得率隨著液料比的增加而增加，隨后得率隨之下降，

在液料比為20∶1時(shí)得率最高，為1.32%。可知，溶劑量過小，提取物質(zhì)不能完全溶出;溶劑量過大時(shí)，超聲波輻射又被溶劑大量吸收，從而影響得率。當(dāng)水提取多糖，液料比在20∶1～30∶1時(shí)，多糖得率隨著液料比的增加而增加，在液料比30∶1～35∶1時(shí)得率之間無顯著差異，隨后得率隨之下降。由于浸提液的后續(xù)工序中需濃縮，若水量增加，工序也隨之增加，因此水提多糖液料比選為30∶1。

圖5 液料比對(duì)得率的影響Fig.5 Effect of ratio of solvent to material on extraction yield

2.3.6 醇析濃度對(duì)多糖得率的影響 乙醇沉淀法提取多糖時(shí)，乙醇的濃度對(duì)多糖得率影響很大。一般情況下，多糖的分子量越大，被沉淀下來所需的乙醇濃度就越小。由圖6可見，當(dāng)乙醇用量為水提取液3倍時(shí)，得率最高，當(dāng)乙醇用量大于水提取液3倍時(shí)，多糖得率隨之下降，這是由于隨乙醇濃度升高，一些多糖中醇溶蛋白分子溶于乙醇中，有些多糖分子與醇溶蛋白相結(jié)合，使多糖也溶于乙醇溶液中，不被沉淀下來，造成多糖得率的降低。

圖6 醇析濃度對(duì)多糖得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction yield of polysaccharides

2.3.7 醇沉溫度對(duì)多糖得率的影響 醇沉法就是利用有效成分能溶于乙醇而雜質(zhì)不溶于乙醇的特性，在加入乙醇后，有效成分轉(zhuǎn)溶于乙醇中而雜質(zhì)則被沉淀出來［10］。醇沉溫度低，沉淀物析出與沉降的速度加快，所需的靜置時(shí)間短，反之則長。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，在4、25℃條件下，多糖得率分別為6.86%和6.25%。由此可見，4℃醇沉效果明顯好于25℃，這是由多糖在不同的溫度下溶解度不同造成的。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表3三萜類物質(zhì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析得知，影響因素顯著性順序?yàn)?D＞C＞B＞A，得率最高組合為A1B3C3D3，即以溫度30℃，時(shí)間50min，提取3次，液料比25∶1。為了對(duì)三萜類物質(zhì)正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，采用此組合，做了3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所測(cè)得三萜類物質(zhì)分別為1.28%，1.30%，1.32%，平均值為1.30%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的數(shù)值與優(yōu)化的結(jié)果相吻合，說明正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是可行的。

表3 樺褐孔菌三萜類物質(zhì)提取條件的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test on triterpenoids extraction conditions

根據(jù)表4多糖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析得知，影響因素顯著性順序?yàn)?D＞C＞B＞A，正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合為 A2B2C3D3，即以提取溫度50℃，提取時(shí)間40min，提取3次，液料比35∶1。但表4中沒有此項(xiàng)組合，故按此組合重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過3次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得多糖分別為6.99%、6.95%、6.93%，平均值為6.96%，高于表4出現(xiàn)最高值，故采用此組合為最優(yōu)組合。

表4 樺褐孔菌多糖提取條件的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test on polysaccharides extraction conditions

3 結(jié)論

本研究利用超聲熱學(xué)及空化技術(shù)，研究醇－水交換提取森林藥食兩用多孔真菌—樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)的最佳提取工藝及技術(shù)。采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲波輔助提取樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)的最佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。得出三萜類物質(zhì)最佳提取工藝為:溫度30℃，時(shí)間50min，提取3次，液料比25∶1，得率為1.30%;多糖最佳提取工藝為:溫度50℃，時(shí)間40min，提取3次，液料比35∶1，得率為6.96%。

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Study on the method for ethanol－water exchanging extraction of biological activity content fromInonotus obliquus

MA Wei－wei，CHEN Wen－h(huán)ua，WANG Xin－h(huán)ong，WAN Xue－lian，WANG De－cai*(College of Public Health，Harbin Medical University，Harbin 150086，China)

Objective:To studya method forethanol－waterexchanging extraction oftriterpenoidsand polysaccharides fromInonotus obliquusby ultrasound thermal and cavitation technology.Methods:ShatteredInonotus obliquus，filtered them by 30 mesh filter sieve，extracted biological activity content by ethanol－water exchanging and ultrasonic technology.Results:The ethanol optimum extraction of triterpenoids was as follow: extraction temperature 30℃，time 50min，extraction times 3，the rate of liquid and solid 25∶1，and the best extraction was 1.30%.The water optimum extraction of polysaccharides was as follow:extraction temperature 50℃，time 40min，extraction times 3，the rate of liquid and solid 35∶1，and the best extraction was 6.96%.Conclusion:The optimum extraction which ethanol－water exchanging extraction of biological activity content fromInonotus obliquusby ultrasonic technology was steady，reasonable and improve comprehensive utilization ofInonotus obliquuseffectively.

Inonotus obliquus;ethanol－water exchanging;ultrasound

TS201.2

B

1002－0306(2012)21－0273－04

2012－04－13 *通訊聯(lián)系人

馬微微(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:植物化學(xué)生物活性物質(zhì)的提取、鑒定、保健功能。