HPLC法同時測定不同品種溪黃草中3種三萜類成分的含量

吳澤青，帥 歐，林 勵，*，邱戊盛，歐先濤，吳攀創(chuàng)

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;

2.廣東萬年青制藥有限公司，廣東汕頭 515064)

HPLC法同時測定不同品種溪黃草中3種三萜類成分的含量

吳澤青1，帥 歐1，林 勵1，*，邱戊盛2，歐先濤2，吳攀創(chuàng)2

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;

2.廣東萬年青制藥有限公司，廣東汕頭 515064)

目的:建立同時測定溪黃草中科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸含量的高效液相色譜法。方法:采用Synergi 4u Fusion RP 80A C18(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex company)色譜柱;流動相:甲醇(A)－0.2%磷酸水(B)(V∶V= 9∶1);等度洗脫;流速:0.6mL·min－1;檢測波長:210nm;柱溫30℃。結(jié)果:科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸分別在0.111～1.111mg/mL(r=0.9999)、0.026～0.256mg/mL(r=0.9999)、0.307～3.067mg/mL(r=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為97.72%、97.08%和97.46%(n=6)，RSD分別為1.24%、1.62%和1.25%。結(jié)論:本法快速、簡便、準確，重復(fù)性好，可用于溪黃草3種主要成分定量分析和質(zhì)量控制。

溪黃草，三萜，高效液相色譜法，測定

中藥溪黃草為民間習(xí)用草藥，用于治療濕熱瀉痢，跌打瘀腫，急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎等疾病［1］，臨床使用廣泛。溪黃草具有保肝抗癌等作用，溪黃草中的科羅索酸和2α，19－二羥基熊果酸具有體外抗乙肝病毒的作用，熊果酸類成分具有顯著的抑制乙肝病毒作用［2－4］。溪黃草為嶺南特色藥材，在廣東各地臨床應(yīng)用普遍，并出現(xiàn)以之為主要原料的保健產(chǎn)品，如溪黃草茶、溪黃草顆粒等，溪黃草在保健品開發(fā)方面具有較大潛力，但尚無較全面的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準對其藥材及產(chǎn)品進行規(guī)范。目前市場上作

“溪黃草”入藥的原植物有線紋香茶菜Rabdosia Iophan－thoides(Buch.－Ham ex D.Don)Hara.及同屬植物狹基線紋香茶菜R.lophanthoides var.gerardiana(Benth.)Hara.、纖花香茶菜R.lophanthoides var.graciliflora(Benth.)Hara.和溪黃草R.serra(Maxim.) Hara.或R.lasiocarpa(Hayata)Hara.［5－6］。溪黃草含萜類、黃酮類、酚類、氨基酸等多種化學(xué)成分。目前對于溪黃草中三萜類成分含量測定的文獻多集中在齊墩果酸［7］、熊果酸［8］、科羅索酸［9－10］等成分。尚未見同時測定四種不同基源的溪黃草多種三萜類成分含量的文獻報道，本工作采用高效液相色譜法(HPLC)對四種不同基源溪黃草三萜類成分含量進行研究，為進一步提高溪黃草藥材的質(zhì)量標(biāo)準研究水平提供科學(xué)依據(jù)。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Results of linear relationship

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溪黃草藥材 由廣東萬年青制藥有限公司提供，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵研究員鑒定為線紋香茶菜Rabdosia Iophanthoides(Buch.－Ham ex D.Don)Hara.、狹基線紋香茶菜Rabdosia lophanthoides var.gerardiana(Benth.)Hara.、纖花香茶菜Rabdosia lophanthoides var.graciliflora(Benth.)Hara.和溪黃草Rabdosia serra(Maxim.)Hara.;齊墩果酸、科羅索酸、熊果酸對照品 購自曼思特生物科技有限公司，批號分別為:MUST－09071701、MUST－10021301、MUST－10111201，純度≥98%;乙腈 色譜純，默克公司;磷酸 天津科密歐化學(xué)試劑廠，優(yōu)級純;甲醇、氯仿、鹽酸 廣州化學(xué)試劑廠，分析純;水為超純水;微孔濾膜 天津津騰公司。

Waters e2695一體機、Waters 2998 PDA檢測器

Waters公司;8002型電熱恒溫水浴鍋 上海市精慧儀器公司;XS 225A型分析天平 Sartorius公司; DFT－200型手提式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為 Synergi 4u Fusion RP 80A C18(250mm × 4.6mm，5μm，Phenomenex company);流動相:甲醇(A)－0.2%磷酸水(B)(V∶V =9∶1);流速0.6mL·min－1;檢測波長:210nm;柱溫: 30℃;進樣量:10μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取五氧化二磷干燥24h以上的科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸對照品適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL分別含科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸111.11、25.56、306.67μg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取溪黃草藥材適量，粉碎，過二號篩，精密稱取4.0g，置150mL圓底燒瓶中，精密加入氯仿100mL，稱定重量，回流提取1h，過濾，取濾液真空濃縮，殘渣用甲醇分次溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 系統(tǒng)適用性實驗 分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入色譜儀，按上述色譜條件測定。在此條件下科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸峰與樣品中其它成分峰均能達到基線分離。三成分與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于3000。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC色譜圖

四種溪黃草HPLC色譜圖如圖1所示。

2.2 標(biāo)準曲線的制備

圖1 四種溪黃草HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of four kinds of Linearstripe Rabdosia Herb

精密吸取混合對照品溶液2、6、10、12、16、20mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密吸取10μL，按1.2.1的色譜條件進樣分析，以各自的峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，濃度X(mg·mL－1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，其回歸方程及線性范圍見表1。

2.3 精密度實驗

在上述色譜條件下，精密吸取混合對照品溶液連續(xù)測定6次，進樣量為10μL，測定峰面積，結(jié)果見表2，科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸峰面積RSD分別為1.52%、1.17%、0.75%，表明精密度良好。

2.4 重復(fù)性實驗

精密稱取同一樣品(狹基線紋香茶菜1批)6份，按1.2.3的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，測得溪黃草樣品中科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸峰面積RSD分別為0.75%、1.22%、0.90%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好，見表3。

2.5 穩(wěn)定性實驗

在上述色譜條件下，取同一樣品(狹基線紋香茶菜1批)，分別于0、2、4、6、12、24h測定，測得溪黃草藥材樣品中科羅索酸、齊墩果酸及熊果酸峰面積RSD分為1.27%、1.54%、1.36%。結(jié)果表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定，見表4。

2.6 加樣回收率實驗

取同一批已知科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸含量的供試品(科羅索酸含量0.3820mg/g，齊墩果酸含量0.0993mg/g，熊果酸含量1.1582mg/g)，平行6份，每份取樣量約2g，精密稱定。按當(dāng)前取樣含量約1∶1精密加入科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸對照品，照1.2.3的方法制備供試品溶液。進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表5～表7，科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸平均回收率分別為97.72%、97.08%、97.46%，RSD分別為

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 Results of precision test

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果Table 3 Results of repeated test

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 4 Results of stability test

表5 科羅索酸加樣回收實驗結(jié)果Table 5 Results of the recovery test of Corosolic acid

表6 齊墩果酸加樣回收實驗結(jié)果Table 6 Results of the recovery test of Oleanolic acid

表7 熊果酸加樣回收實驗結(jié)果Table 7 Results of the recovery test of Ursolic acid

1.24%、1.62%、1.25%。表明方法的準確度較好。

2.7 樣品含量測定

分別取待測樣品，按1.2.3的方法制備供試品溶液，在1.2.1色譜條件下，進行樣品含量測定，結(jié)果見表8。

3 結(jié)論

本法快速、簡便、準確，重復(fù)性好，可用于溪黃草藥材3種主要成分定量分析和質(zhì)量控制。不同基源的溪黃草藥材科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸含量有所不同。四種藥材中科羅索酸含量由高到低順序排列分別為溪黃草、線紋香茶菜、狹基線紋香茶菜及纖花香茶菜;齊墩果酸含量由高到低順序排列分別為溪黃草、線紋香茶菜、狹基線紋香茶菜及纖花香茶菜;熊果酸含量由高到低順序排列分別為狹基線紋香茶菜、纖花香茶菜、線紋香茶菜及溪黃草。

表8 四種溪黃草含量測定結(jié)果Table 8 Results of contents of Linearstripe Rabdosia Herb

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊)［M］.上海:上海人民出版社，1977:2511.

［2］胡英杰，賴小平，劉中秋，等.狹基線紋香茶菜(溪黃草)的化學(xué)成分與抗乙肝病毒作用研究［J］.中草藥，2005，36(11): 1612－1615.

［3］謝春英.溪黃草提取物預(yù)防大鼠急性肝損傷的實驗研究［J］.中藥材，2007，30(12):1582－1583

［4］劉銀花，陳秀琴，沈婕，等.溪黃草配伍虎杖煎劑對大鼠實驗性肝損傷的保護作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(2): 334－335.

［5］陳建南，賴小平，劉念.廣東溪黃草藥材的原植物調(diào)查及商品鑒定［J］.中藥材，1996，19(2):73－74.

［6］賴小平，陳建南，陳林奴，等.中藥溪黃草的研究進展［J］.廣州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1995，12(4):56－58.

［7］劉凡.溪黃草的生藥學(xué)研究［D］.廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2010:47－53.

［8］李楚源，鄧喬華，黃琳，等.溪黃草中熊果酸含量測定方法學(xué)研究［J］.中外醫(yī)療，2009(28):155－156.

［9］吳劍鋒，劉斌，祝晨蔯，等.不同采收期溪黃草中2α－羥基熊果酸含量的動態(tài)研究［J］.中草藥，2004，31(1):81－83.

［10］吳劍鋒，劉斌，祝晨蔯，等.不同施肥區(qū)域溪黃草中2α－羥基熊果酸含量的比較［J］.藥學(xué)進展，2004，28(7):318－321.

HPLC simultaneous determination of three triperpenoids components in Linearstripe Rabdosia Herb from different species

WU Ze－qing1，SHUAI Ou1，LIN Li1，*，QIU Wu－sheng2，OU Xian－tao2，WU Pan－chuang2
(1.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medcine，Guangzhou 510006，China;
2.Guangdong Enterlife Pharmacy Company Limited，Shantou 515064，China)

Objective:To establish an HPLC method for simultaneous determination of 2α－h(huán)ydroxy－ursolic acid，oleanolic acid and ursolic acid in Linearstripe Rabdosia Herb from different species.Methods:The HPLC system consisting of Synergi 4u Fusion RP 80A C18column(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex company)and a solution system of methanol－phosphoric acid(V∶V=9∶1)as the mobile phase with isocratic elution was adopted.The flow rate was set at 0.6mL·min－1，the detection wavelength was 210nm and the column temperature was 30℃.Results: The linear ranges of 2α－h(huán)ydroxy－ursolic acid，oleanolic acid and ursolic acid were 0.111～1.111mg/mL(r=0.9999)，0.026～0.256mg/mL(r=0.9999)，0.307～3.067mg/mL(r=0.9999)respectively.Conclusion:The average recoveries(n =6)were 97.72%(RSD=1.24%)，97.08%(RSD=1.62%)，97.46%(RSD=1.25%)respectively.The method was quick，simple and accurate with good reproducibility and could be used for determination and quality control of the three main components in Linearstripe Rabdosia Herb.

Linearstripe Rabdosia Herb;triperpenoids;HPLC;determination

TS218

A

1002－0306(2012)21－0296－04

2012－04－23 *通訊聯(lián)系人

吳澤青(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:中藥資源開發(fā)與新藥研究。