葡萄汁調控斷奶大鼠小腸抗氧化能力與形態發育的影響

阮 征，劉世強，黃小流，周 艷，歐陽崇學，印遇龍，3，*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047;

2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌 330031;

3.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，湖南長沙 410125)

葡萄汁調控斷奶大鼠小腸抗氧化能力與形態發育的影響

阮 征1，2，劉世強1，2，黃小流1，2，周 艷1，2，歐陽崇學1，2，印遇龍1，2，3，*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047;

2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌 330031;

3.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，湖南長沙 410125)

目的:研究葡萄汁對斷奶大鼠小腸發育的影響。方法:選取16只斷奶SD大鼠，分為2個組:對照組，葡萄汁組。記錄第0、7、14、21、28、35d大鼠的體重及每周總采食量。35d后處死取樣，準確稱量大鼠脾臟重量，記錄小腸長度，測定回腸中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性，應用組織學方法對回腸的形態學指標及淋巴細胞數進行檢測。結果:與對照組相比，35d時葡萄能顯著增加斷奶大鼠的體重(p＜0.05)、體重生長率(p＜0.05)、小腸長度(p＜0.05)、回腸中的SOD活力(p＜0.05);顯著降低回腸中MDA的含量(p＜0.05)。結論:葡萄汁能促進斷奶大鼠小腸發育。

葡萄汁，斷奶大鼠，小腸，抗氧化，形態

腸道是哺乳動物營養成分消化吸收的主要場所，其功能正常與否對營養成分的消化、吸收以及營養物代謝具有重要影響。哺乳動物提前或早期斷奶后出現消化不良、腹瀉等癥狀，稱為斷奶應激綜合征［1－2］。研究表明，主要原因是斷奶應激對哺乳動物腸道組織的損傷很大(包括形態、結構和功能)［3－4］，同時發現斷奶動物的免疫力低下，(腸道)免疫系統功能發育與成熟緩慢［5］。因此，采取營養物調控來減小斷奶應激對腸道的不利影響，對嬰幼兒的生長發育具有重要作用。葡萄作為一種常見的水果，含有大量的生理活性物質，其中一些具有良好的抗氧化，抗腫瘤，抗衰老，提高機體免疫等作用，如白藜蘆醇、黃酮、類黃酮、原花青素等［6－7］。然而目前對葡萄中多酚、類黃酮、花色苷素等活性物質的研究多集中在單體成分對疾病的緩解作用［8－9］，對葡萄整體的營養評價或生物活性研究較少。我們推測葡萄汁能通過提高腸道的抗氧化能力，來促進(或提高)斷奶期腸道的生長發育。本研究以斷奶SD大鼠為模型，通過灌喂葡萄汁，檢測斷奶大鼠體重的變化，小腸長度及其形態學，以及腸道組織的抗氧化酶，探討葡萄對斷奶大鼠小腸發育的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

普通飼料 南昌大學實驗動物中心提供;巨峰紫葡萄 南昌天虹商場;SOD、MDA試劑盒 南京建成生物試劑公司。

0.5%鹽酸乙醇分色液 2.5mL的鹽酸，500mL 75%的乙醇;伊紅乙醇染色液 醇溶伊紅Y 1g溶于100mL 95%乙醇;Ehrlich蘇木精染色液 將2g蘇木精溶于100mL無水乙醇中配置成2%蘇木精乙醇溶液，15g硫酸鋁鉀溶于100mL蒸餾水中，配成15%硫酸鋁鉀溶液，然后將該兩種溶液混合，再加入10mL冰乙酸，最后加入0.2g碘化鈉，配好的溶液密封，暗處保存。

SC－3614型離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司;722E型分光光度計 上海光譜儀器有限公司;石蠟切片機 德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗材料的預處理和主要成分及含量的測定［10－11］購買回來的新鮮葡萄，先用蒸餾水沖洗干凈，去籽后，榨汁，取其汁液即刻給大鼠進行灌胃。每日攝入的葡萄汁中含糖 12g/100mL，總多酚610mg/100mL(以沒食子酸當量來表示)，總黃酮17.3mg/100mL(以兒茶素當量來表示)。

1.2.2 動物及分組 兩周齡斷奶SD大鼠，購自上海西普樂－必凱實驗動物有限公司。本實驗分為2個處理組，每組8只。葡萄汁組大鼠按每千克大鼠質量灌喂4g新鮮葡萄汁，對照組用相同劑量的蒸餾水灌喂，每日上午一次，同時給予普通飼料，自由飲水，連續35d。

1.2.3 樣本采集及處理 至第35d，用斷頭法處死大鼠，剖腹，游離小腸，測量長度，剪取回腸中間兩段，約2～3cm，一份置于10%中性甲醛固定液中，一份儲藏于－80℃冰箱;取出脾臟，稱重。

1.2.4 檢測指標及方法

1.2.4.1 大鼠體重增長率的測定 記錄第0、7、14、21、28、35d各大鼠的體重，按以下方法計算:

體重增長率(%)=(X－Y)/Y×100

X為第0、7、14、21、28、35d各大鼠的體重(g);Y為第0d體重(g)。

1.2.4.2 MDA含量以及SOD活性的測定 將保存于－80℃的回腸組織于4℃解凍、洗凈、碾磨，用生理鹽水配制成10%的回腸組織液。按照試劑盒上的說明書測定回腸組織中MDA含量和SOD的活性。

1.2.4.3 免疫器官及小腸長度指數測定 在實驗至第35d，對各大鼠準確稱重后，斷頭法處死，解剖剝離并取出脾臟和小腸，用濾紙輕輕蘸去表面的血液后進行準確稱重，小腸直接測量其自然長度。記錄各實驗大鼠的脾臟重量、小腸長度。免疫器官指數及小腸長度指數的計算公式如下［12－13］:

脾臟指數(g/kg)=脾臟重量(g)/大鼠活重(kg)

小腸長度指數(cm/g)=小腸長度(cm)/大鼠活重(g)

1.2.4.4 常規石蠟切片的制作及小腸黏膜形態指標和淋巴細胞數的測定［14］動物宰殺后，立即取出回腸部分，用生理鹽水沖洗腸道內容物，取末端回腸2cm置于10%中性甲醛固定液中固定24h。然后取出組織塊，組織塊經過梯度乙醇(50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、無水乙醇，每級停留時間2～4h)進行脫水處理，然后將脫水的組織分別放入二甲苯∶無水乙醇(1∶1，v/v)和二甲苯中(每停留時間約1h)透明處理。經過透明處理的組織塊，依次經過浸蠟、包埋、修快、切片和粘片步驟。而后用二甲苯對切片進行脫蠟(大約20min)、復水(依次為無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、蒸餾水，每級停留時間大約2min)、Ehrlich蘇木精溶液染色約10min，用蒸餾水洗去多余染料后，加入0.5%鹽酸乙醇溶液分色10s，蒸餾水洗滌，最后加入伊紅乙醇染色液染色1min。染好色的切片再放入95%乙醇和無水乙醇中各脫水約3min，用二甲苯∶無水乙醇(1∶1，v/v)透明處理1h，中性樹膠封片，觀察。用Motic Med6.0數碼醫學圖像采集處理系統采圖，測量回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度，采用麥克奧迪顯微圖像分析軟件進行形態學指標觀察測量。在40倍目鏡下觀察切片，每個切片選取5個全視野，記錄每個視野下的淋巴細胞數，取平均值。

1.3 數據統計與分析

實驗數據用SPSS17.0統計軟件進行T檢驗，統計顯著性水平為p＜0.05，數據以平均數±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 葡萄汁對斷奶大鼠體重增長率的影響

體重是衡量哺乳動物生長發育的重要指標，在一定程度上反映了腸道發育情況。

由圖1可知，從第21d開始葡萄汁組的大鼠體重增長率開始高于對照組，但無顯著性差異;直到第35d時，葡萄汁組斷奶大鼠的體重增長率有顯著性提高(p＜0.05)，說明葡萄對大鼠生長率的影響具有一定時間依賴性，這與James［15］等的研究結果長期飲用葡萄汁能顯著提高體重增長率一致。

圖1 葡萄汁對斷奶大鼠體重增長率的影響Fig.1 Effect of grapes juice on growth rate of weight of weaned－rats

2.2 葡萄汁對斷奶大鼠脾臟、小腸長度指數變化的影響

小腸是動物消化和吸收營養物質的主要部位，其長度在一定程度上反映了腸道的發育狀況［16］。脾臟是體內最大的淋巴器官，脾臟的發育不良會對體液免疫和細胞免疫造成巨大的傷害，進而影響動物的生長發育［17］。

表1 葡萄汁對大鼠體重、脾重、小腸長度、脾臟及小腸長度指數的影響(n=8) Table 1 Effect of grapes juice on weight，weight of spleen，length of small intestine and index of spleen and small intestine(n=8)

表3 葡萄汁對大鼠回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度、淋巴細胞數的影響(n=8)Table 3 Effect of grapes juice on villus height，crytp depth，lymphcytes in ileum(n=8)

由表1可知，與對照組相比，葡萄汁組斷奶大鼠的體重和小腸長度分別升高了15.5%和18.2%，且具有顯著性差異(p＜0.05)。兩組之間的脾重、脾臟指數、小腸指數均無顯著性差異。表明葡萄汁在一定程度上促進了大鼠小腸的發育，小腸長度的增長可能與體重的增加有一定的關系。

2.3 葡萄汁對斷奶大鼠回腸中SOD活性、MDA含量變化的影響

SOD是體內重要的抗氧化酶，能清除超氧負離子自由基，阻斷自由基鏈式反應，降低體內脂質過氧化發生水平，從而保護機體細胞和組織不受自由基的損害，延緩機體衰老過程［18］。丙二醛(MDA)為脂質過氧化產物，其含量可反映機體內脂質過氧化程度［19］，間接反映細胞損傷程度。

由表2可知，與對照組相比，葡萄汁組斷奶大鼠回腸組織中的SOD活性升高了45%，差異顯著(p＜0.05)。葡萄汁組斷奶大鼠回腸組織中的MDA含量降低了47.3%，差異顯著(p＜0.05)。表明葡萄汁能提高斷奶大鼠腸道的抗氧化能力。

表2 葡萄汁對大鼠回腸中SOD、MDA的影響(n=8) Table 2 Effect of grapes juice on SOD，MDA in ileum(n=8)

2.4 葡萄汁對大鼠回腸黏膜絨毛高度、隱窩深度、淋巴細胞數變化的影響

腸道是斷奶期動物最容易受到影響的組織器官之一，絨毛高度與隱窩深度是反映腸道功能狀況的常用指標。隱窩深度降低表明絨毛上皮成熟細胞增加，絨毛高度與隱窩深度的比值體現了小腸的消化吸收能力，可反映小腸的功能狀態［20］。

通過形態學觀察發現，35d時葡萄汁組斷奶大鼠回腸末端絨毛高度高于對照組，隱窩深度更大(圖2)。與對照組相比，葡萄汁組斷奶大鼠回腸絨毛高度、隱窩深度、淋巴細胞數分別升高了 22.1%、13.3%、8.3%，但均未造成顯著性差異(表3)。對照組和葡萄汁組的絨毛高度與隱窩深度比值分別為1.39和1.50，說明葡萄汁干預后刺激了絨毛的生長。結合兩組間體重增加的顯著性差異(表1)，說明葡萄能增強斷奶大鼠小腸的吸收功能。

圖2 回腸末端HE染色的黏膜形態(×100)Fig.2 Morphology of terminal ileum mucous using histochemistry

3 討論

3.1 水果中所含有的生理活性物質種類豐富，加上各種物質的相互作用，其整體的功能作用及安全性可能強于單一的膳食補充劑［21］。Eberhardt等人［22］研究發現100g新鮮蘋果的抗氧化能力相當于1500mg維生素C的抗氧化能力，當含量50mg/mL時其抑制肝腫瘤細胞生長率可達57%。另有研究表明每天攝入500mg維生素C具有促氧化作用［23］。Castilla P等［24］研究發現紅葡萄汁比維生素E能更好的降低血總膽固醇和載脂蛋白B的含量，增加高密度脂蛋白膽固醇的含量。Décordé等［25］用蘋果、紫葡萄及其汁液干預動脈粥樣硬化的大鼠，發現它們均能顯著降低血漿總膽固醇和高密度膽固醇的含量，增強肝臟的抗氧化能力，且果汁的效果強于水果本身。因此通過膳食添加水果或其汁液對疾病的預防和緩解具有潛在的能力。

3.2 斷奶期的哺乳動物免疫功能和胃腸道功能發育尚不健全，給嬰幼兒選擇功能性食品時其安全性更受人們的重視，因此添加富含生理活性物質的食物來改善該時期嬰幼兒的不適癥狀，給預防和緩解斷奶期綜合征帶來了新思路。腸道是斷奶期動物最容易受到影響的組織器官之一，其功能是否穩定直接影響到動物的生長發育情況，本實驗旨在探討葡萄汁對斷奶大鼠腸道發育的影響，及可能的作用機理。實驗結果表明葡萄汁對小腸發育有良好的促進作用。斷奶應激使腸道絨毛萎縮，隱窩深度變淺，從而影響斷奶動物的消化吸收功能［26］。與對照組相比，葡萄汁干預后小腸長度增加了18.2%，具有差異顯著性(p＜0.05)，絨毛高度和隱窩深度升高了22.1%和13.3%。葡萄汁不僅在一定程度上增加絨毛高度和隱窩深度，并能提高腸道的免疫功能，葡萄汁干預組腸道淋巴細胞數增加了8.3%。腸道絨毛高度，隱窩深度以及淋巴細胞數無顯著差異性，可能與實驗時間有關。

3.3 研究表明斷奶容易造成腸道的氧化應激，主要表現為抗氧化酶系的減少，以及脂質過氧化產物的累積［27］，而氧化應激可以直接影響腸道黏膜的結構［28］。因此推測葡萄汁對腸道的保護作用可能與提高腸道的抗氧化能力有關。席鵬彬等人［29］研究發現谷氨酰胺二肽能顯著提高斷奶仔豬血清谷胱甘肽過氧化物酶和超SOD活力。在仔豬的膳食中添加精氨酸或精氨酸生素能顯著降低腸道MDA的濃度，增加空腸谷胱甘肽的水平［30］。本實驗結果表明，葡萄汁組斷奶大鼠回腸組織中SOD活性升高了45%，與對照組相比具有顯著差異性，MDA含量降低了47.3% (p＜0.05)。

4 結論

實驗結果表明在膳食中添加葡萄汁能促進斷奶大鼠的小腸發育，這可能與提高小腸的抗氧化能力有關。今后可進一步探索葡萄汁對斷奶期動物的免疫調節，以及腸道微生物的影響，并進行濃度梯度實驗來探索最佳的使用劑量。

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Effect of grapes juice on antioxidant capacity and morphology of intestine in weaning rats

RUAN Zheng1，2，LIU Shi－qiang1，2，HUANG Xiao－liu1，2，ZHOU Yan1，2，OUYANG Chong－xue1，2，YIN Yu－long1，2，3，*(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang 330047，China;
2.College of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China;
3.Institute of Subtropical Agriculture，Chinese Academy of Sciences，Changsha 410125，China)

Objective:Study on the effect of grapes juice on small intestinal development in weaning rats.Method:16 weaning rats were randomly assigned to 2 groups as follows:normal control(NC)group and grape juice group.The weight of each rat at 0，7，14，21，35d and total food weight for every rat were recorded in every week.The weight of spleen and length of small intestine，the activity of superoxide dismutase(SOD)，the concentration of malonaldehyde(MDA)，morphology and lymphocytes in ileum were measured after all rats killed at 35d.Result:The weight，the growth rate of weight，length of small intestine and activity of SOD in ileum treated with grapes juice were significantly increased compared to rats in normal control group(p＜0.05)，and concentration of MDA in ileum was significantly lower respectively(p＜0.05).Conclusion:Grapes juice could improve growth of small intestine in weaning rats.

grape juice;weaning rats;small intestine;antioxidant capacity;morphology

TS218

A

1002－0306(2012)21－0340－05

2012－05－10 *通訊聯系人

阮征(1978－)，男，博士，副教授，研究方向:功能性食品及營養代謝。

食品科學與技術國家重點實驗室青年骨干研究基金項目(SKLF－QN－201110);國家自然科學基金(31001014)。