代謝組學方法在食品安全中的應用研究進展

邱緒建，耿 偉，劉光明，陳勝軍，林 洪

(1.集美大學生物工程學院，福建廈門 361021;

2.陜西省咸陽市質量技術監督局食品安全風險監測中心，陜西咸陽 712000;

3.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東廣州 510300;

4.中國海洋大學水產品安全實驗室，山東青島 266003)

代謝組學方法在食品安全中的應用研究進展

邱緒建1，耿 偉2，劉光明1，陳勝軍3，林 洪4，*

(1.集美大學生物工程學院，福建廈門 361021;

2.陜西省咸陽市質量技術監督局食品安全風險監測中心，陜西咸陽 712000;

3.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，廣東廣州 510300;

4.中國海洋大學水產品安全實驗室，山東青島 266003)

代謝組學方法作為一個新興的重要研究工具，在藥物研發、疾病診斷、植物生理、食品營養學及環境科學等很多領域中得以廣泛應用。本文主要介紹代謝組學的研究方法在食品安全分析應用中的最新進展，以推動我國在快速檢測檢驗方面的技術進步和突破，從而達到保障食品安全的目的。

代謝組學，快速檢測方法，食品安全

代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后新近發展起來的一門學科，為當前研究的熱點之一。代謝組學的目標是全面研究生物體系代謝產生的小分子代謝物(分子量通常＜1500u)，然后通過這些代謝組分的指紋分析得到有用的信息［1］。代謝組學對人類疾病、新藥研發、食品營養學、植物生理及環境科學等研究都有重要的推動作用，并日益成為非常重要的研究工具［2－6］。近年來，氣質聯用色譜(GC－MS)，液質聯用色譜(LC－MS)及高通量高分辨率核磁共振譜(NMR)等技術手段被廣泛應用。此外，用于化合物分析的色譜圖處理軟件和數據庫也不斷更新完備，這使得小分子化學物質的分離鑒別相對快速簡易，代謝組學研究因而得以迅速發展完善［7－10］。代謝組學研究可分為非靶向代謝組學和靶向代謝組學。非靶向代謝組學(又稱發現代謝組學)以發現盡可能多的代謝產物，從而獲取代謝產物的產生模式或者指紋分析為主要的研究方向。非靶向代謝組學通常尋找有統計學意義的代謝物，并與所研究的生物狀態或過程進行關聯，揭示其內在的變化規律。靶向代謝組學分析是以預先確定的一組化合物為分析目標，需要準確的定性和定量分析［11］。靶向代謝組學通常驗證事先提出的假設，針對特定的一組代謝物，研究其變化特點。靶向分析一般需要對分析樣品進行選擇性的提取和較高程度的純化，以盡可能去除與測定目標無關的干擾物質。我國近年來食品安全事件屢屢發生。根據衛生部報道，2010年全國因微生物污染造成的食物中毒有81起，4585人中毒，16人死亡。微生物性食物中毒事件的報告起數和中毒人數最多，分別占總數的36.82%和62.10%［12］。因此，為適應公共衛生事件應急處理快速反應的需要，研發食源性致病菌的快速檢測方法，對于加強對食源性致病菌的監測和控制具有重要意義。代謝組學方法作為一個新興的重要研究工具在食源性致病菌檢測中的應用潛力不容忽視。

此外，不法分子對食品故意摻假也造成了嚴重的食品安全問題，給人民群眾的健康和生命安全帶來威脅。傳統的感官評價和常規質量指標檢測往往難于區分摻假食品。代謝組學的方法著重于食品所有成分組成的整體定性定量分析，因而能對摻假的食品加以科學的區分鑒別。代謝組學方法在分析評價轉基因食品中也能發揮重要作用。轉基因食品的化學成分組成及含量和傳統食品之間的差異借助于代謝組學這個研究工具可以得到快速簡便的識別。這對于轉基因食品的安全評價和轉基因食品的監管都有重要意義。本文就代謝組學的研究方法及其在食品安全檢測分析中的應用研究做一綜述。

1 代謝組學的研究方法

代謝組學研究的一般流程包括實驗設計、樣品收集及處理、分離檢測、數據處理及分析、生物標志分子的發現和確認及生物學意義解釋等，其中檢測和數據處理較為重要，是代謝組學不可或缺的重要步驟［6］。

1.1 樣品收集及處理

樣品收集及處理要根據研究目的進行設計。固體樣品如土豆可在液氮條件下粉碎或者用凍干的方法。通常凍干處理可以使代謝產物濃縮富集，而且能避免不同批次的樣品之間水分含量的差異給分析結果帶來的影響［13］。對于非靶向代謝組學的研究，因為要分析的化學物質并不預知，這就需要對于幾種溶劑和提取方法進行比較，以盡可能得到全面的分析結果。不同生物樣品特點各異，具體提取方法需要通過實驗確定最優方案［14］。靶向代謝組學因為已知需要提取物的化學特性，可以有針對性的選擇溶劑和提取方法。如Cavaliere［15］等用甲醇/水/甲酸70∶30∶1對葡萄果實當中多酚化合物進行提取。提取物在分析前有時需要衍生化，衍生化通常是進行氣相色譜(GC)分析前為使檢測物易于揮發而做的化學處理。

1.2 分離檢測

分離檢測是代謝組學的一個關鍵步驟。現有的分離檢測技術平臺有高壓液相色譜(HPLC)、超高壓液相色譜(UPLC)、氣相色譜(GC)、毛細管電泳(CE)等分離方法以及紫外(UV)、質譜(MS)、核磁共振(NMR)和近紅外光譜(NIR)等檢測方法［4］。液質聯用(LC－MS)及氣質聯用(GC－MS)分析較為常見。另外，直接進樣質譜法(Direct infusion MS)技術不需要分離步驟，可直接進樣分析較快取得結果，但其離子化易受基質影響［16］。對于各種分離檢測技術在代謝組學方法中應用存在的優缺點，很多綜述作了較為深入詳細的介紹［4，17－19］。隨著高通量及高靈敏度分離檢測技術的不斷進步，代謝組學無疑將會得到進一步發展。

1.3 數據處理及分析

代謝組學的數據處理及分析主要包括化學物定性定量和統計學分析。分離的化學物質通過色譜數據庫檢索并和標準品的保留時間進行對比來定性鑒別。代謝組學數據分析以多維數據分析(Multivariate Data Analysis，MVDA)為主。常見的有主成分分析法(Principal Component Analysis，PCA)，主成分分析法可以用來歸類區分不同處理樣品之間的不同。其他方法還有神經網絡分析方法(Neural Network，NN)，簇類分析(Hierarchical Cluster Analysis，HCA)等。代謝組學的數據處理也包括統計預測模型的建立。這其中偏最小二乘法(Partial Least Square，PLS)最為常用［6］，其他還有偏最小二乘法顯著性分析(PLSDiscriminant Analysis，PLSDA)，軟獨立建模分類法SIMCA(Soft Independent Modeling of Class Analogy，SIMCA)等［20－21］。統計方法的選擇是根據研究需要而定，代謝組學的大量數據結果需要利用統計學軟件來分析，其中包括MATLAB、SAS、SPSS、SIMCA等。Hiller等［22］設計了一個 MetaboliteDetector的免費軟件，專門用來處理氣質色譜數據分析。

1.4 生物標志分子的確認及其生物學意義解釋

代謝組學的研究極有可能發現生物標志分子。生物標志分子的發現和確認，可以提供非常有價值的信息，對于解釋生物代謝的變化規律和相關機制具有重要意義。如生物標志分子的檢測可以用于疾病的早期診斷、微生物的檢測、藥物毒理的評價等［23］。

2 在食源性致病菌快速檢測中的應用

食源性致病菌在生長過程中能合成并釋放出有機小分子物質。通過檢測分析這些小分子物質，可以有助于推斷是否有致病菌的存在。由于很多微生物的許多揮發性代謝產物有較高的相似性，僅憑一兩種代謝組份往往很難區分不同種類的微生物。代謝組學的研究可以對不同微生物生長過程中所有這些揮發性代謝產物的產生模式進行統計學上的多維數據分析，得出準確可靠的判斷。而在分析這些代謝產物的過程中，也很有可能發現某個或某些特異性的生物標志分子，從而更加有利于目標致病菌的檢測。如Tian等［24］研究發現通過氣質聯用色譜，轉基因的大腸桿菌和普通大腸桿菌可以區分開來。這其中琥珀酸、脯氨酸和天門冬氨酸是用來區分的主要的標志性代謝物。

2.1 食源性致病菌快速檢測的方法

食源性致病菌的檢測方法很多。傳統檢測方法時間長，需要進行很多項生化實驗分析才能得到確認結果，過程繁瑣而且耗時耗力。因此，研究快速簡便的檢測食源性致病菌的方法是目前食品微生物安全領域研究的熱點之一。分子生物學的聚合酶鏈式反應(PCR)和酶聯免疫(ELISA)的方法是目前主要的快速檢測技術。這些方法要對樣品進行富集培養增菌，還包括DNA提取和擴增、熒光探針雜交、各種酶、試劑和PCR儀器等，增加了檢測的復雜程度，往往需要24～48h才能得到結果。而且這些技術如操作不當，還易造成假陽性或假陰性結果的出現［25－26］。表面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)檢測速度很快，大約1h，但是檢測限非常高［27］。代謝組學方法的研究目標是致病菌的代謝小分子的產生規律，與分子生物學PCR檢測方法思路有明顯區別，下面對其在食源性致病菌檢測的研究現狀做一簡要概述。

表1 代謝組學法在食源性致病菌檢測中的應用研究Table 1 Application study on rapid detection of foodborne pathogens by metabolomics

2.2 代謝組學方法在食源性致病菌檢測中的應用

國內外關于代謝組學在食源性致病菌的快速檢測上的應用研究尚不多見。表1總結了最近的有關這方面的一些研究概況。

Nakai等［28］利用氣相色譜研究了牛肉和三文魚樣品中沙門氏菌的檢測方法，沒有利用富集培養液，直接對牛肉保溫增菌，然后分析了病菌污染樣品的揮發性代謝產物的產生模式，結果發現能夠區分污染樣品和對照品，但何種病菌仍需進一步確證。Ogihara等［29］在后續研究中，調查了沙門氏菌和其他5種病菌在胰蛋白胨大豆肉湯培養液(Tryptic Soy Broth，TSB)的生長代謝模式并成功進行了檢測，而且提出了先把牛肉樣品保溫培養，然后再到培養液中增菌，提取揮發性代謝物以鑒別細菌的方法。

Siripatrawan和 Harte［30］利用固相微萃取和氣質聯用色譜分析的方法，檢測污染沙門氏菌的苜蓿芽包裝產品。該方法對樣品揮發性小分子直接頂空取樣，提取制備相對簡單。檢測的沙門氏菌起點在10000CFU/g，檢測限過高，但建立的統計模型能較好的利用揮發性代謝產物分析結果來預測沙門氏菌總數。

Xu等［31］發現豬肉中的腐敗菌和沙門氏菌在常溫保存下所產生的代謝物不同，因而能加以區分豬肉是否污染沙門氏菌。該研究發現纈氨酸、肌酐、肉豆蔻酸、棕櫚酸、油酸等代謝產物能起重要的區分作用，能否作為沙門氏菌在豬肉中檢測的生物標志分子，有待于進一步研究確認。研究結果顯示了代謝組學指紋分析方法是一個很有應用價值的研究工具。

Bhattacharjee等［32］研究比較了鮮牛肉和熟成牛肉污染沙門氏菌和對照樣品中揮發性有機分子的組成的不同。頂空固相微萃取結合氣質色譜分析結果發現某些揮發性分子如3－羥基－2－丁酮是隨著沙門氏菌的生長繁殖而增加的(p＜0.05)。該研究僅定性比較檢測了少數幾種代謝物的產生規律，尚不能應用到具體檢測中。

Cevallos－Cevallos等［33］對雞肉和絞牛肉中大腸桿菌O157∶H7及沙門氏菌進行了檢測。他們分別用毛細管電泳二極管陣列檢測方法、液質色譜和氣質色譜對代謝產物進行分離鑒別。氣質色譜分析得到的圖譜信息更豐富而且更易區分對照樣品和病菌污染樣品，因而氣質分析被采用。在細菌培養液生長代謝的氣質色譜分析結果的基礎上，研究者設立統計模型并正確檢測了含有大腸桿菌O157∶H7或沙門氏菌的培養液樣品，但是尚不能完美的預測食品樣品中是否污染大腸桿菌O157∶H7或沙門氏菌。研究者因此將污染病菌后的絞牛肉和雞肉樣品的數據加入模型后得到新的統計模型，從而完全正確的預測了食品樣品中的病菌，沒有假陽性或假陰性結果出現。

3 在檢測食品摻假中的應用

受利益驅動，食品摻假現象層出不窮。如在牛奶中添加三聚氰胺、食用油中添加地溝油、純果汁中添加糖和檸檬酸、初榨橄欖油混摻其他低廉食用油等。常規食品分析檢測目標單一，往往不能檢出這些摻假食品。代謝組學基于全面分析食品成分組成的整體分析方法，因此在檢測非特定目標物方面有其他檢驗方法所沒有的優勢。研究表明，很多摻假食品可以通過代謝組學的技術手段來鑒別。Hajimahmoodi等［34］利用氣相色譜和偏最小二乘法統計模型來檢測棉籽油、橄欖油、豆油及葵花籽油的混合物。所建立的統計模型能較好的對這四種油組成分別定量，從而可以對每種食用油是否添加其他種類的油做出快速判斷。Surowiec等［35］利用代謝組學的研究方法對機械回收肉(Mechanically recovered meat)和手工剔骨肉等進行了區分。機械回收肉是用高壓處理胴體碎塊，除去不可食用的組織后剩下的肉糊，價格低廉，消費者不認可。歐盟規定此類產品不屬于肉的范疇。研究結果表明，氣質聯用色譜分析結合統計模型預測的方法能就機械回收肉和其他不同來源的肉樣品及香腸制品進行判斷區分，具有實際應用價值。Ogrinc［36］利用同位素比質譜法(Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS)對果汁摻假、葡萄酒摻假和橄欖油摻假進行了分析研究。分析檢測結果可以通過主成分分析法(Principle Component Analysis，PCA)或人工神經網絡(Artificial Neural Networks，ANN)處理來區分摻假產品和正常產品。可以預見，代謝組學方法在食品摻假檢測的應用將會越來越廣泛而極有可能成為檢測摻假食品的主要技術手段。

4 在檢測轉基因食品安全分析中的應用

轉基因食品的安全評價中有一個實質等同性的原則［37］。這需要對轉基因食品成分和傳統對照的非轉基因食品進行分析比較差異。代謝組學的分析檢測技術手段如氣質聯用色譜、液質聯用色譜、毛細管電泳質譜和核磁共振等都可以檢測分析轉基因食品的成分組成。Chang等［38］對轉基因大米和非轉基因大米用非靶向代謝組學方法進行分析，發現轉基因大米和非轉基因大米成分差異不大，而環境因素引起的成分差異較為顯著。Kim等［39］用傅立葉紅外光譜和核磁共振儀器對轉基因土豆和非轉基因土豆做了比較分析。多維數據分析結果表明，轉基因土豆和非轉基因土豆實驗樣品并無顯著區別，反而新鮮土豆和貯藏一周后的土豆差異明顯。該研究顯示了代謝組學能有效評估轉基因產品成分組成差異，是一個快速而簡便的方法。

5 結論

總之，代謝組學是一種新興的重要的技術手段，在食品安全分析檢測中已經充分顯現出了其潛力和優勢。近年來，人民群眾對于食品安全和營養健康日益關注，充分利用代謝組學這個研究工具，建立靈敏可靠特異的快速檢測方法，對于預防和減少食源性疾病的發生、監控檢測食品摻假、加強轉基因食品安全、保障人民群眾健康等都具有重要的現實意義。

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A review on the application of metabolomics method in food safety

QIU Xu－jian1，GENG Wei2，LIU Guang－ming1，CHEN Sheng－jun3，LIN hong4，*
(1.College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China;2.Quality and
Technical Supervision Bureau，Food Safety Risk Monitoring Center of Xianyang，Xianyang 712000，China;
3.Chinese Academy of Fishery Sciences，The South China Sea Fisheries Research Institute，Ministry of Agriculture Key Laboratory of Aquatic Products Processing，Guangzhou 510300，China;
4.Ocean University of China Aquatic Product Safety Laboratory，Qingdao 266003，China)

Metabolomics is an emerged important research tool after genomics and proteomics.Recently，metabolomics had been widely used in many disciplines including drug discovery，disease diagnosis，plant physiology，food science and environmental science.This review introduced the basic research process of metabolomics and its application in food safety.The advances in this research field could help to improve the rapid detection technology in China and ensure food safety.

metabolomics;rapid detection method;food safety

TS201.6

A

1002－0306(2012)21－0369－05

2012－04－23 *通訊聯系人

邱緒建(1974－)，男，博士，研究方向:食品質量與安全。

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD28B05);集美大學科研基金資助。