混菌降解稻草纖維素產葡萄糖的條件研究

劉 毅，袁月華

(湖南機電職業技術學院生物化工系，湖南長沙 410151)

混菌降解稻草纖維素產葡萄糖的條件研究

劉 毅，袁月華

(湖南機電職業技術學院生物化工系，湖南長沙 410151)

利用從環境中篩選出的一株木霉與一株曲霉，在以稻草粉為主要碳源的液體培養基中混菌發酵，所得的粗酶液催化降解經預處理的稻草粉得到葡萄糖液。在單因素實驗基礎上進行正交實驗，正交實驗表明，粗酶液用量對稻草粉降解為葡萄糖影響最大，其次為溫度，然后是pH，稻草粉濃度對降解影響最小。稻草粉最優降解條件為:粗酶液用量為降解液總體積的3%，降解液初始稻草粉濃度60g/L，pH4.8，降解溫度50℃，此條件下降解率可達80%。

混菌，降解，稻草，纖維素

通過微生物降解作用使稻草中主要成分纖維素降解為可生物利用的還原糖［1－2］，然后轉為有效能源，如乙醇或其它重要化工原料(乳酸、檸檬酸)等是稻草合理利用的有效途徑。為了提高降解效率，人們進行了大量的研究工作［3－5］。我們從環境中篩選出了一株木霉［Trichoderma viride］(T1)和一株曲霉［Jspergillus sp］(T3)，在以稻草粉為主要碳源的液體發酵條件下這兩株菌有較強的產纖維素酶能力，兩菌混合發酵時纖維素酶活力明顯增強。但是，產纖維素酶的最佳條件與纖維素酶催化糖化稻草的最佳條件并不一致，所以，本文研究解決直接利用混合菌群發酵得到的粗酶液糖化稻草粉的條件，并對條件進行優化，以提高稻草纖維素降解為葡萄糖的產率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻草粉 采自湖南省沅江市農村水稻田(當年產)，洗凈后自然風干，粉碎過40目篩，經微波與堿聯合處理后洗凈干燥備用［6］;木霉［Trichoderma viride］(T1)和曲霉［Jspergillus sp］(T3) 本實驗室篩選;液體產酶發酵培養基 40g固形物(稻草粉∶麩皮=3∶2)，(NH4)2SO42.0g，尿素3.0g，KH2PO43.0g，CaCl20.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CoCl23.0mg，FeSO4· 7H2O 7.5 mg，ZnSO4·7H2O 2.0mg，MnSO4·H2O 2.5mg，加水至1000m L，pH5.5。

THZ－82恒溫振蕩水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;HZQ－F100型全溫度振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠;BS124S電子天平 德國賽多利斯; UV—1100紫外/可見分光光度計 上海益倫環境科技有限公司;YXQ－LS－30SII型立式壓力蒸汽滅菌器

上海博迅實業有限公司;SW－CJ－1FD型凈化工作臺 上海博迅實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 混菌粗酶液的制備 將木霉(T1)與曲霉(T3)按同濃度孢子懸液比值3∶2混合后，以5.5%接種量接入液體產酶發酵培養基中，在250m L三角瓶中裝液100m L，于28℃振蕩培養箱(180r/min)中振蕩培養144h。然后將發酵液用脫脂棉過濾除去菌體及雜質，所得清液即本實驗用稻草纖維素糖化酶粗酶液。

1.2.2 單因素實驗 降解反應在250m L三角瓶中進行。加入適量的粗酶制液和pH4.8的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，并按0.2g/g稻草粉加入Tween80［7］，混合均勻。控制總反應液體積為100m L，在不同的粗酶液用量、稻草粉濃度、pH、糖化溫度等條件下進行反應，測定濾出液中的還原糖含量。

1.2.3 條件優化實驗 根據單因素實驗結果，選取粗酶液用量、稻草粉濃度、pH、溫度作為研究對象。按照4因素3水平L9(34)進行正交實驗［8］。考察糖化過程中各因素的影響水平大小，找出最優糖化條件。降解正交實驗的因素與水平設計見表1。

表1 稻草粉降解正交實驗因素水平表Table 1 Factor levels of degradation of rice straw powder by orthogonal experiment

1.2.4 還原糖的測定 還原糖采用DNS法測定［9］。

1.2.5 降解率(糖化率) 糖化率(%)=［降解反應產生還原糖質量(g)/稻草粉質量(g)］×100

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 粗酶液用量對降解的影響 控制初始稻草粉濃度為80g/L，初始pH5.5，溫度50℃，分別加入不同體積的粗酶液，使粗酶液體積占反應液總體積的0.5%、1%、2%、3%，降解48h，分析不同粗酶液用量對降解效率的影響，結果見圖1。

圖1表明，在本實驗條件下，稻草降解為還原糖的得率隨著粗酶液用量的增加而增加，0～24h降解速率較快，隨后逐漸減緩。粗酶液用量由0.5%增加到2%時，降解率增加十分明顯，但粗酶液用量由2%增大到3%時，降解率增加幅度較小。稻草磨粉經微波與堿聯合處理后，便于纖維素酶與纖維素結合，這是前24h水解速率較快的主要原因，但隨著水解的進行及粗酶液用量的增大，能提供給酶結合的有效位點減少，因而降解率增幅減小。綜合生產成本等因素，采用2%(降解液體積比)粗酶液較為合適。

圖1 粗酶液用量對降解效率的影響Fig.1 Effect of crude enzyme dosage on efficiency of degradation

2.1.2 稻草粉濃度對降解的影響 控制初始pH5.5，溫度50℃，粗酶液用量2%，分別采用40、60、80、100、120g/L稻草粉進行降解實驗，反應48h，分析稻草粉濃度對降解的影響，結果如圖2。

圖2 稻草粉濃度對降解的影響Fig.2 Effect of rice straw powder concentration on degradation

由圖2可見，隨著稻草粉濃度的增加，降解速率逐漸下降。發酵至48h時，稻草粉濃度由40g/L增加至100g/L，降解率下降幅度不大，而繼續增加稻草粉濃度至120g/L時，降解率的降幅十分明顯。發生這種現象的原因，可能是稻草粉濃度較大時，稻草粉不宜混勻，不利于纖維素酶與纖維素的充分接觸;同時可能是在高稻草粉濃度下產生的降解產物對降解過程產生了抑制作用［10］。考慮到利用稻草粉降解液發酵檸檬酸時需要較高的還原糖濃度，因而需要適當較高的稻草粉濃度［11］，所以選擇實驗條件下稻草粉濃度為100g/L。

2.1.3 pH對降解的影響 控制溫度50℃，粗酶液用量2%，稻草粉濃度100g/L進行降解實驗，分別采用不同的初始pH，反應48h，分析初始pH對降解的影響，結果如圖3。

從圖3可見，pH對稻草粉降解有顯著影響，在本實驗條件下，pH4.5～5.5時，降解率可達70%以上，這與一般纖維素酶最適pH范圍一致。pH偏離此范圍增大或減小時，降解率都顯著下降，其中pH4.8時降解率可達最高。本實驗用粗酶液中的纖維素酶是來源于兩種霉菌混合發酵液的復合酶系，顯然該酶系催化稻草粉糖化降解的最適pH為4.8，當pH發生改變時，會改變酶系各基團的解離狀態而影響酶分子活性中心的結構，影響其與稻草纖維素分子結合與催化降解的能力，pH變化過大還會導致酶分子整體空間結構的變化而減弱催化活性。

圖3 初始pH對稻草粉降解的影響Fig.3 Effect of initial pH value on degradation of straw powder

2.1.4 溫度對降解的影響 控制粗酶液用量2%，稻草粉濃度100g/L，初始pH4.8進行降解實驗，在不同溫度下反應48h，分析溫度對稻草粉降解的影響，結果如圖4。

圖4 溫度對稻草粉降解的影響Fig.4 Effect of temperature on degradation of straw powder

由圖4可見，在反應的前5h內，較高溫度(55、60℃)下降解速率較高，但在此后，40～55℃條件下降解率隨時間而增大，特別是50℃時降解率增加最為明顯，而60℃條件下降解率增加變得十分緩慢，顯然50℃是此反應條件下的最適溫度。出現這種現象的可能原因是，在最適溫度以下時，隨溫度的升高降解反應速率加快，而當溫度超過了最適溫度，酶分子會大量變性而失活，使降解反應減慢，溫度越高，酶變性越快，降解速率降低得也越快。在反應初始階段，酶失活較少、而酶促反應隨溫度的提高而加速;而當反應進行了一段時間后，較高溫度(60℃)下酶大量失活，使降解速率顯著降低。

2.2 優化實驗結果分析

結合單因素實驗的結果，進行正交實驗，結果如表2。

表2 稻草粉降解正交實驗方案與結果分析Table 2 Scheme of rice straw powder degradation by orthogonal test and result analysis

由表2可見，影響稻草粉降解為葡萄糖的各因素的主次順序為:粗酶液用量＞降解溫度＞pH＞稻草粉濃度，顯然粗酶液用量對稻草粉降解為葡萄糖影響最大，溫度的影響也較顯著，而稻草粉濃度與pH的重要性相近，均相對較小。經結果分析可以確定，稻草粉降解為葡萄糖的最優條件組合為:粗酶液用量為降解液總體積的3%，降解液初始稻草粉濃度60g/L，pH4.8，降解溫度50℃。經驗證實驗測定，在此條件下的降解率為80%。

3 結論

本實驗用混合糖化菌纖維素酶活較強，稻草經預處理后，有利于纖維素在混合菌產生的粗纖維素酶液作用下降解為葡萄糖。實驗結果表明，粗酶液用量是影響稻草粉降解為葡萄糖產率大小的最重要因素，其次是降解溫度，pH和稻草粉濃度對降解率的影響相對較小。利用木霉(T1)與曲霉(T3)在合適的條件下混菌發酵制得的粗酶液降解經處理的稻草粉的優化組合為:粗酶液用量為降解液總體積的3%，降解液初始稻草粉濃度60g/L，pH4.8，降解溫度50℃，在此條件下降解率達80%。粗酶液用量增加，降解得率會明顯提高，但過多地使用酶液會導致前期混菌發酵制備纖維素酶的工作量過大、成本增加，所以綜合考慮各種因素，可采用適當較少的粗酶液用量，而適當延長降解時間，也可提高降解率并獲得較高葡萄糖濃度。

［1］Gray K A，Zhao L H，Emptage M.Bioethanol［J］.Current Opinion in Chemical Biology，2006，10(2):141－146.

［2］李十中.生物質工程前沿領域關鍵技術研究進展［J］.科技導報，2005，23(5):9－11.

［3］Selig M J，Knoshaug E P，Adney W S，et al.Synergistic enhancement of cellobiohydrolase performance on pretreated corn stover by addition of xylanase and esterase activities［J］. Bioresource Technology，2008，99(11):4997－5005.

［4］Rajeev Kumar，Wyan C E.Effect of xylanase supplementat of cellulase on digestion of com Stover solids prepared by leading pretreatment technologies［J］.Bioresource Technology，2009，100 (18):4203－4213.

［5］Zhang QZ，He GF，Wang J，et al.Two－stage co－hydrolysis of rice straw by Trichoderma reesei ZM4－F3 and Pseudomonas aeruginosa BSZ－07［J］.Biomass and Bioenergy，2009，33(10): 1464－1468.

［6］朱圣東，吳元欣，喻子牛，等.微波預處理稻草糖化工藝研究［J］.林產化學與工業，2005，25(1):112－114.

［7］姚日生，鄧勝松，齊本坤，等.Tween80對稻草水解及同步糖化與發酵產乳酸的影響［J］.精細化工，2008，25(2): 155－158.

［8］李云雁，胡傳榮.實驗設計與數據處理［M］.北京:化學工業出版社，2005:79－90.

［9］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術［M］.北京:高等教育出版社，2001:1－3.

［10］Gregg D J，Saddler JN.Factors affecting cellulose hydrolysis and the potentialofenzyme recycle to enhance the efficiency ofan integrated wood to ethanol process［J］.Biotechnology and Bioengineering，1996，51(4):375－383.

［11］Andreas Rudolf，Malek Alkasrawi，Guido Zacchi，et al.A cornparison between batch and fed－ batch simultaneous saccharification and fermentation of steam pretreated spruce［J］. Enzyme and Microbial Technology，2005，37(2):195－204.

Study on the condition of straw cellulose degradation to produce glucose by m ixed culture

LIU Yi，YUAN Yue－hua
(Biochemical Engineering Department of Hunan Mechanical＆Electrical Polytechnic，Changsha 410151，China)

In this research，a strain of trichoderm a and aspergillus filtered out from the environment was used to ferment in powder－liquid med ium where the main carbon source was rice straw.Along with the ferm entation，the p retreated rice straw powder was catalytic deg raded into g lucose by enzyme.There was orthogonal test based on sing le fac tor experim ent.The orthogonal experiment showed that the c rude enzyme liquid dosage caused the biggest influence on the degradation of straw powder，second was tem perature and followed by pH value，and the straw powder concentration caused the m inimum effects on deg radation.The op timal conditions of deg radation of rice straw powder was:the percentage of the volume of crude enzyme liquid in total deg radation liquid was 3%，initial straw powder concentration was 60g/L，the pH value was 4.8，the deg radation temperature was 50℃.Under the op tim al cond itions，the deg radation rate could be ab le to reach 80%.

m ixed culture;deg radation;rice straw;cellulose

TS201.3

A

1002－0306(2012)19－0191－03

2012－03－02

劉毅(1964－)，男，本科，副教授，研究方向:生物化工技術應用。

湖南省科技廳科技計劃項目(2011FJ3131)。