海參磷脂型二十碳五烯酸對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠腎臟功能改善作用的研究

劉月嬌，徐雷雷，柳 東，李 冰，李 輝，張 珣，王靜鳳

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003)

海參磷脂型二十碳五烯酸對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠腎臟功能改善作用的研究

劉月嬌，徐雷雷，柳 東，李 冰，李 輝，張 珣，王靜鳳*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003)

目的:研究海參磷脂型二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid Phosphatidylcholine，EPA－PC)對鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)誘導的糖尿病大鼠腎臟功能的改善作用。方法:通過腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，經不同劑量海參EPA－PC(25和75mg/kg，以EPA含量計)灌胃8w。實驗結束后，分別檢測大鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量、腎臟指數、24h尿量、血清尿素氮(BUN)、尿總蛋白、白蛋白(mAlb)、尿酸(UA)含量及β－N乙酰葡萄糖苷酶(NAG)活性。結果:海參EPA－PC可顯著改善糖尿病大鼠的口服葡萄糖耐量(p＜0.05)，降低糖尿病大鼠的腎臟指數(p＜0.01)、24h尿量、血清BUN、尿總蛋白、mAlb、UA含量及NAG活性(p＜0.01)。結論:海參EPA－PC對糖尿病大鼠的腎臟功能具有較好的改善作用。

多不飽和脂肪酸，海參EPA－PC，糖尿病腎病，血糖，尿白蛋白，腎臟保護

糖尿病腎病(diabetic nephropathy)是糖尿病慢性并發癥之一，以血管損傷的腎小球病變為主，并伴有尿蛋白，腎功能衰退等癥狀，成為糖尿病患者死亡的主要原因之一。二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)是海洋魚類中含量較為豐富的ω－3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，與人體的生理功能密切相關［1－2］。研究發現［3］，EPA可維持大腦、視網膜等的正常功能和生長發育，具有抑制血小板凝聚、調血脂、抗血栓、抑制炎癥、提高機體免疫力等功效。張敏芳等研究發現［4］，EPA具有改善患糖尿病小鼠的腎組織病變的作用。EPA－PC是一種EPA和磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)Sn－2位相結合形成的化合物，和單純的EPA相比，海參EPA－PC具有較高的生物利用率、抗氧化性以及易于被小腸吸收的特性［5］。本實驗以海參EPA－PC為研究對象，觀察其對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟的改善作用，以進一步挖掘海參 EPA－PC的生物利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干冰島刺參 購于青島市水產品市場;健康SD雄性大鼠 體重(200±20)g，SPF級，北京維通利華動物實驗技術有限公司，合格證號:SCXK(京)2007－0001;鏈尿佐菌素(Streptozotocin，STZ) Sigma;葡萄糖測定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司;血清尿素氮、尿酸、β－N乙酰葡萄糖苷酶測定試劑盒 南京建成科技有限公司;尿微量白蛋白測試盒(免疫比濁法) 上海太陽生物技術公司;TGL－16G型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;680型酶標儀 美國Bio－Rad。

1.2 實驗方法

1.2.1 海參EPA－PC的制備 取干冰島刺參，粉碎成粉末，加水浸泡24h，去水，加入甲醇、氯仿浸提24h。過濾得濾液，在濾液中加入適量的蒸餾水并充分攪拌，靜置分層后收集下層有機溶劑層，Na2SO4·5H2O干燥后低溫旋轉蒸發，得到黏稠脂質樣品。經丙酮、甲醇清洗除雜，即得到EPA含量較高的脂質樣品［6］。經高效液相色譜法［7］測得PC含量為72%，氣相色譜法［7］測得脂肪酸組成中EPA含量為30%。將EPA－PC與等摩爾膽固醇混合，用少量氯仿溶于茄形瓶中，沖入氮氣保護，旋蒸成均勻薄層，生理鹽水震蕩混勻，沖入氮氣后低溫超聲溶解成水溶性懸濁液，即為實驗用海參EPA－PC。

1.2.2 模型建立和動物實驗 隨機選取10只健康SD大鼠作為正常對照組。其余所有大鼠禁食不禁水12h，于當日和次日分別以45、10mg/kg的劑量兩次腹腔注射STZ(溶解于pH4.4的0.1mol/L檸檬酸－檸檬酸納緩沖液)，正常對照組大鼠注射等體積檸檬酸－檸檬酸納緩沖液。飼養72h后，對造模大鼠禁食不禁水5h，尾靜脈采血測空腹血糖值，以血糖值≥16.7mmol/L者作為成功糖尿病模型。

將造模成功的大鼠按體質量和血糖值隨機分為糖尿病模型對照組、海參EPA－PC低、高劑量組(25、75mg/kg·bw，以EPA含量計)，每組10只。分組當日開始灌胃海參EPA－PC，正常組和模型組灌胃生理鹽水，灌胃體積為10m L/kg，每天一次，連續8w。實驗期間，大鼠自由進食和飲水。于末次給藥后，大鼠代謝籠單只收集24h尿液，離心，取上清液分裝，4℃保存待測。于末次給藥后，大鼠禁食10h，乙醚麻醉，腹主動脈取血、處死。摘取雙腎，稱重。收集血液、分離血清，用于生化指標的測定。

1.2.3 血糖的測定 于末次給藥后，大鼠禁食不禁水5h，尾靜脈取血20μL加入到0.4m L蛋白沉淀劑中，混勻，在室溫下靜置7m in，離心，取上清液，參照試劑盒法測定空腹血糖值。

1.2.4 葡萄糖耐量的測定 于末次給藥后，大鼠禁食不禁水5h，以2g/kg的劑量空腹灌胃葡萄糖溶液。分別于灌胃后的0、0.5、2h經尾靜脈取血，測定各時刻的血糖值，并按公式計算曲線下面積(area under the curve，AUC):AUC(h·mmol/L)=1/2×(A+B) ×0.5+1/2×(B+C)×1.5。其中，A、B、C分別為0、0.5、2 h的血糖值。

1.2.5 腎臟指數 腎臟肥大指數=［雙側腎臟重量之和(g)/體重(g)］×100。

1.2.6 血清尿素氮排出量的測定 參照試劑盒方法測定。

1.2.7 尿中總蛋白、白蛋白排出量的測定 總蛋白采用雙縮脲試劑法測定，白蛋白排出量參照試劑盒方法檢測。

1.2.8 尿酸(UA)排出量和 β－N乙酰葡萄糖苷酶(NAG)排泄率的測定 參照試劑盒方法測定。

1.2.9 統計學處理 采用SPSS11.0軟件處理數據，進行單因素方差分析，同時進行LSD比較，以p＜0.05作為具有統計學意義上的差異，實驗結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 對空腹血糖量及葡萄糖耐量的影響

如表1所示，模型對照組大鼠空腹血糖濃度以及葡萄糖耐量和正常組相比顯著升高，具有統計學意義(p＜0.01)。灌胃海參EPA－PC后，劑量組大鼠空腹血糖值和糖耐量均下降。和正常組相比，模型組大鼠空腹血糖濃度以及葡萄糖耐量顯著升高，具有統計學意義(p＜0.01)。其中和模型組相比高劑量組的口服葡萄糖耐量降低了14.4%，得到明顯的改善(p＜0.05)。說明海參EPA－PC對糖尿病大鼠具有較好的降血糖作用。

表1 海參EPA－PC對糖尿病大鼠空腹血糖量、AUC及腎臟指數的影響(n=10，±s)Table 1 Effect of EPA－PC on plasma glucose，AUC and kidney indice in diabetic rats(n=10，±s)

表1 海參EPA－PC對糖尿病大鼠空腹血糖量、AUC及腎臟指數的影響(n=10，±s)Table 1 Effect of EPA－PC on plasma glucose，AUC and kidney indice in diabetic rats(n=10，±s)

注∶##p＜0.01與正常組相比較;*p＜0.05、＊＊p＜0.01與模型組相比較，表2同。

組別 空腹血糖值(mmol/L) AUC (h·mmol/L)腎臟指數(g/kg) 5.99±0.75 14.23±1.22 0.61±0.02模型對照組 23.28±2.84## 49.57±2.70## 1.2±0.09##低劑量組 23.26±4.87 45.56±3.46 1.19±0.15高劑量組 21.78±4.52 42.42±3.01* 1.07±0.06正常對照組＊＊

2.2 對腎臟指數的影響

如表1所示，模型對照組大鼠腎臟指數較正常組相比升高了96.721%(p＜0.01)。灌胃海參EPAPC后，劑量組大鼠腎臟指數明顯降低。其中，高劑量組大鼠較模型組下降了10.83%(p＜0.01)，說明海參EPA－PC對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟肥大具有一定的改善作用。

2.3 對血清BUN含量的影響

血清BUN是蛋白質分解產物，在人體內經腎小球過濾隨尿液流出體外。因此，血清BUN的含量可作為評價腎功能的標志物。如表2所示，灌胃海參EPA－PC后，劑量組大鼠血清BUN含量下降。與模型對照組相比，低、高劑量組大鼠血清BUN分別下降了34.65%、44.59%(p＜0.01)。

2.4 對尿中總蛋白、白蛋白排出量的影響

尿蛋白及白蛋白排出量增多是腎臟病變的早期表現之一［8］。如表2所示，與正常對照組相比，模型對照組大鼠的尿蛋白和白蛋白排出量顯著升高(p＜0.01)。灌胃海參EPA－PC后，劑量組大鼠尿中總蛋白、白蛋白排出量均降低。與模型對照組相比，低、高劑量組大鼠尿中總蛋白排出量分別降低了30.72%和47.89%(p＜0.01)，白蛋白排出量分別降低了 17.35% 和 46.94%(p＜0.01)，說明海參EPA－PC對糖尿病腎病大鼠的腎臟病變具有顯著改善作用。

表2 海參EPA－PC對糖尿病大鼠24h排尿量、總蛋白、mAlb、BUN、UA排出量及NAG活性的影響(±s，n=10) Table 2 Effect of EPA－PC on the 24h urine volume，the excretion of protein，the levels ofmAlb in urine，BUN in plasma，UA and NAG in urine in diabetic rats(n=10，±s)

表2 海參EPA－PC對糖尿病大鼠24h排尿量、總蛋白、mAlb、BUN、UA排出量及NAG活性的影響(±s，n=10) Table 2 Effect of EPA－PC on the 24h urine volume，the excretion of protein，the levels ofmAlb in urine，BUN in plasma，UA and NAG in urine in diabetic rats(n=10，±s)

組別 24h排尿量(mL)總蛋白排出量(mg/L) mAlb排出量(mg/L) BUN排出量(mmol/L) UA排出量(mg/L) NAG活性(U)正常對照組 11.25±5.49 1.49±0.18 0.43±0.02 12.42±0.36 3.77±0.19 0.52±0.06模型對照組 133.83±19.86## 3.32±0.29## 0.98±0.11## 48.46±8.02## 16.36±2.53## 1.36±0.31##低劑量組 71.00±36.37＊＊ 2.30±0.22＊＊ 0.81±0.08 31.67±16.68＊＊ 11.94±4.11* 0.91±0.22*高劑量組 37.33±10.04＊＊ 1.73±0.18＊＊ 0.52.±0.14＊＊ 26.85±8.42＊＊ 6.47±2.21＊＊ 0.66±0.17＊＊

2.5 對24h尿量和尿酸(UA)排出量的影響

尿量增多可視為糖尿病的一個重要癥狀。如表2所示，模型對照組大鼠24h尿量顯著增加(p＜0.01)，灌胃海參EPA－PC后，劑量組大鼠24h尿量降低。低、高劑量組較模型組大鼠24h尿量分別降低了46.95%和72.11%(p＜0.01)，說明海參EPA－PC對改善大鼠多尿癥狀有顯著效果。

如表2所示，模型組大鼠與正常組相比，UA排出量顯著升高(p＜0.01)，灌胃海參EPA－PC后，劑量組大鼠UA排出量降低。低、高劑量組較模型組大鼠UA排出量分別降低了27.02%和60.45%(p＜0.05，p＜0.01)，說明海參EPA－PC可以有效的改善腎小球濾過功能，降低體內蛋白質、核酸等的分解，對體內代謝循環起到調節的作用。

2.6 對尿液β－N乙酰葡萄糖苷酶(NAG)活性的影響

NAG是一種溶酶體酶，當腎實質性病變及蛋白質自腎小球濾過后排出量升高時，將引起尿中NAG活性增加。因此，NAG活性增高可作為糖尿病腎病的早期診斷［9］。如表2所示，模型組大鼠與正常組相比，NAG活性顯著升高(p＜0.01)。低、高劑量組較模型組大鼠NAG活性分別降低了33.09%和51.47% (p＜0.05，p＜0.01)，說明海參EPA－PC對腎小球有一定的保護作用。

3 討論與結論

糖尿病腎病是糖尿病中的一種慢性微血管并發癥，發病的主要特征為血糖濃度升高，葡萄糖耐量減退，腎小球肥大，出現尿蛋白和腎功能受損等現象［10］。本實驗利用STZ誘導SD大鼠，導致實驗大鼠血糖值升高而建立糖尿病模型，探討了海參EPA－PC對糖尿病大鼠的腎臟改善作用。結果表明，糖尿病大鼠喂食海參EPA－PC后，其高血糖、多尿及腎小球濾過作用下降等癥狀得到顯著改善，提示海參EPAPC具有改善腎臟功能的顯著作用。

高血糖使腎小球灌注率和濾過率增加，造成腎小球濾過膜受損，因而控制空腹血糖值和葡萄糖耐量在改善糖尿病腎病的腎臟功能上至關重要［11］。實驗結果顯示，喂食海參EPA－PC的糖尿病腎病大鼠的糖耐量有良好的改善。張敏芳發現［12］，EPA對糖耐量情況的改善有利于減輕糖尿病腎病的炎癥和氧化應激狀態，控制糖尿病病情。這與本文的研究結果一致，說明海參EPA－PC能顯著改善糖尿病大鼠高血糖癥狀，調節腎臟功能。糖尿病腎病損傷腎小球毛細血管，造成血清BUN含量及尿中總蛋白、白蛋白排出量增高。有報道顯示，糖尿病腎病引發腎小球毛細血管基底膜增厚，導致腎小球發生硬化，使蛋白濾過量超過腎小管的重吸收量，從而引起尿中蛋白含量的升高［13］。由于糖尿病導致腎小管對葡萄糖的重吸收增加而競爭性抑制了對UA的重吸收，使UA排泄增加［14］。當腎小管受損時，存在于腎近曲小管上皮細胞溶酶體中的NAG不能由正常的腎小球濾過作用而濾出，引起尿中NAG升高［7］。本實驗研究結果顯示海參EPA－PC可以顯著改善糖尿病大鼠體內的BUN，以及尿中總蛋白、mAlb、UA及NAG的排出量。結果提示海參EPA－PC可以降低腎小球和腎小管的受損程度，提高其濾過功能，從而改善糖尿病腎病大鼠的腎臟功能。

有研究報道稱，EPA能夠減輕糖尿病腎病大鼠腎小球系膜基質的積聚和間質纖維化程度，對腎組織病變具有改善作用［4］，而且能夠使高糖誘導的炎癥因子表達明顯降低，減輕腎臟炎癥反應［15］。提示海參EPA－PC可能是通過改善糖尿腎病大鼠病變的腎組織結構，降低炎癥基因的表達從而對腎臟起到的保護作用，具體的作用機制尚在進一步研究中。

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Protection of EPA－PC liposome on kidney of diabetic rats induced by STZ

LIU Yue－jiao，XU Lei－lei，LIU Dong，LIBing，LIHui，ZHANG Xun，WANG Jing－feng*
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

Ob jective:To study the p rotective effects of Eicosapentaenoic Acid Phosphatidylcholine(EPA－PC)on kidney of d iabetic rats induced by Strep tozocin(STZ).Methods:Diabetes mellitus induced by STZ were adm inistered by d ifferent dosages of EPA－PC(25 mg/kg，75 mg/kg)by stomach perfusion，for8 weeks.At the end of the experiment，the ind ices inc lud ing the changes of the levels of fasting b lood g lucose，Oralg lucose tolerance，the renal index，the 24h urine volume，the levels of BUN in p lasma，the excretion of p rotein，m Alb，BUN，UA and NAG in urine were determ ined.Results:The EPA－PC showed remarkab le hypog lycem ic effected on Oral g lucose tolerance of d iabetic rats(p＜0.05)，and decreased the renal p rotein，m Alb，UA and NAG in urine had reduced significantly(p＜0.01).Conc lusion:EPA－PC can effec tively im p rove the kidney func tion in d iabetic rats.

ω－3 polyunsaturated fatty acids;Eicosapentaenoic Acid Phosphatidylcholine;d iabetic nephropathy; b lood－g lucose;m Alb;p rotec tion of kidney

R965

A

1002－0306(2012)19－0331－04

2012－02－27 *通訊聯系人

劉月嬌(1990－)，女，本科，研究方向:海洋生物活性。

國家自然基金資助項目(30972284);海洋公益性行業科研專項資金資助項目(201105029);國際科技合作項目(2010DFA31330);浙江省重大科技專項(2008C02009);泰山學者建設工程專項經費。