水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的HPLC-UVD法測定

陶昕晨，黃 和，*，李志清，高 平，廖建萌，黃國方，羅 林，陳 宏

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524025；

2.廣東省湛江市質量計量監督檢測所，廣東湛江 524043)

水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的HPLC-UVD法測定

陶昕晨1，黃 和1，*，李志清2，高 平2，廖建萌2，黃國方2，羅 林2，陳 宏2

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524025；

2.廣東省湛江市質量計量監督檢測所，廣東湛江 524043)

建立同時檢測水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的HPLC－UVD法。以2%堿性乙酸乙酯作為提取溶劑，正己烷脫脂后直接經高效液相色譜進行分析。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考在0.10～10.00mg/L范圍內有良好的線性關系。在添加濃度為0.25～5.00mg/kg時，平均回收率在81.00%～102.93%之間，RSD在1.95%～7.10%之間。氯霉素的檢出限為0.01mg/kg，甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限為0.02mg/kg。

高效液相色譜，氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考，水產品，殘留

氯霉素類（Chloramphenicols，簡稱CAPs）屬酰胺醇類（Amphemicols）廣譜抗生素。包括氯霉素及其衍生物，主要有氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphnicol，TAP）和氟苯尼考（Florfenicol，FF）。氯霉素有很強的毒副作用，能夠導致再生障礙性貧血癥，不可逆，且與使用劑量和頻率無關，美國、歐盟、日本等很多國家都禁止在動物源性食品中檢出。中國在2002年也把它列為違禁藥物，禁止在動物食品中檢出。甲砜霉素對血液系統的毒性比氯霉素小，但可以抑制人體免疫系統、紅細胞和血小板的生成，除中國和日本外，歐共體和美國均禁用于食品動物。我國農業部規定其在牛、豬和魚等可食用組織中最高殘留限量為50μg/kg[1]。氟苯尼考雖不會引起再生障礙性貧血癥，但對動物胚胎有影響。我國農業部規定其在可食性動物組織中最高殘留限量為1000μg/kg[1]。氯霉素類藥物由于有良好的抗菌和藥理特性，特別是甲砜霉素和氟苯尼考不易產生耐藥性，與同類藥物之間不存在交叉耐藥性，很多對氯霉素產生耐藥性的菌株對這兩種藥物仍然敏感，現已成為水產養殖病害防治的常用藥物。目前檢測氯霉素類藥物殘留的方法有氣相色譜法[2－6]及氣相色譜－串聯質譜法[7－8]、高效液相色譜法[9－11]及液相色譜－串聯質譜法[12－14]、超高效液相色譜法[15]及超高效液相色譜－串聯質譜法[16－17]等。這些方法前處理比較復雜，耗時長，成本高。且甲砜霉素與氟苯尼考均為常用藥，樣品基體中可檢出的含量較高，而色譜－質譜聯用法同時檢測這類化合物的檢測限一般在1μg/kg以下，在定量時常需進行大比例稀釋。所以液相色譜法更適合于檢測。本研究采用2%堿性乙酸乙酯提取，正己烷脫脂，高效液相色譜－雙通道紫外檢測法同時測定水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，相關方法未見報道，該方法檢出限與報道的液相色譜紫外檢測法的檢出限相比要低，且峰型較好，抗干擾性強，可操作性強，回收率和精確度好，滿足甲砜霉素和氟苯尼考殘留限量的檢測要求，同時也適合對氯霉素的殘留進行檢測，因此可以在日常檢測中應用。

圖1 氯霉素類藥物結構式Fig.1 Chemical structures of CAPs

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素（CSA號：56－75－7） 純度為99%；甲砜霉素（CSA號：15318－45－3） 純度為98.5%；氟苯尼考（CSA號：7321－34－2） 純度為99%；標準品 購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；HPLC級乙腈 購自德國Merck公司；乙酸乙酯、正己烷等 均為分析純；水為去離子水；對蝦、羅非魚 均由湛江國聯水產開發股份有限公司提供。

高效液相色譜儀（Waters Alliance2695/2489） 美國Waters公司；METTLER－TOLEDO XS－205電子分析天平 上海蘭易科學儀器有限公司；Sartorius arium－611VF超純水機 上海摩速科學器材有限公司；BP252組織搗碎機 北京中科科爾器材有限公司；XW－80A漩渦混勻器、HU3120B超聲波清洗器 上海比朗儀器有限公司；Sigma 3－18K高速冷凍離心機 北京博勱行儀器有限公司；美國N－EVAP111氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取0.010g（精確至0.0001g）氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準品，用乙腈分別溶解定容到100mL棕色容量瓶中，配制成100μg/mL標準儲備液，4℃冰箱保存，有效期3個月。使用時用流動相逐級稀釋儲備液成一系列濃度的工作液。

1.3 樣品預處理

對蝦去頭、去殼、去附肢，取肌肉部分；羅非魚去鱗、去皮，取背部和腹部肌肉。用高速搗碎機將樣品搗碎后置于－18℃以下保存。實驗時將樣品自然解凍至室溫。

1.4 樣品提取與凈化

稱取2.0g（精確到0.01g）樣品于50mL離心管中，加10mL含2%的濃氨水、25%～28%乙酸乙酯，漩渦混勻1min，再加入5g的無水硫酸鈉，振蕩提取30min后，4000r/min離心10min，重復上述操作1次，合并上清液，50℃下氮吹近干，再加入2mL流動相溶解殘渣，漩渦混勻1min，加入5mL乙腈飽和的正己烷，漩渦混勻1min，4000r/min離心10min，棄去上層正己烷溶液，重復脫脂1次，取下層溶液過0.45μm的有機系濾膜上機測定。

1.5 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18反相色譜柱（250mm× 4.6mm i.d.，5μm）；流速：1mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：10μL；氯霉素檢測波長278nm，甲砜霉素和氟苯尼考檢測波長225nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將稀釋好的10μg/mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準液在波長190～370nm范圍進行紫外掃描，發現氯霉素在278nm、甲砜霉素和氟苯尼考在224nm處有最大吸收，故選擇氯霉素檢測波長為278nm，甲砜霉素和氟苯尼考檢測波長為224nm。

2.2 流動相的優化

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都屬于極性物質，一般選用甲醇－水或乙腈－水作流動相[18]。本實驗比較了這兩種流動相的效果，發現甲醇－水作流動相時，其保留時間比較短，容易被雜質峰干擾。等度洗脫時，調高乙腈比例（30%～40%），甲砜霉素保留時間太短，容易受干擾；調低乙腈比例（15%～20%）時，雖然延長了保留時間，但其峰型都變寬，導致檢出限升高，所以選用梯度洗脫。經過大量樣品測定，梯度洗脫時受到的干擾很少。結果如圖2所示。

圖2 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準溶液色譜圖（10.00mg/L）Fig.2 Chromatogram of CAP，TAP and FF standard solution（10.00mg/L）

2.3 提取溶劑的選擇

常用丙酮、乙腈和乙酸乙酯等作為氯霉素類藥物的提取溶劑[18]。本實驗比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、2%堿性乙酸乙酯、乙酸乙酯－乙腈（1∶1）和2%堿性乙酸乙酯－乙腈（1∶1）對空白對蝦中3種氯霉素類藥物的提取效果，2%堿性乙酸乙酯和2%堿性乙酸乙酯－乙腈（1∶1）對3種氯霉素類藥物的提取效果相當，但加入的乙腈使得在濃縮的過程中變慢，還增加了提取成本，所以選擇2%堿性乙酸乙酯作為最佳提取溶劑。通過大量實驗樣品分析，該提取液對3種氯霉素類藥物的回收率較高，樣品液澄清，色譜的分離效果好。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

在本方法所確定的實驗條件下，以峰面積（y）為縱坐標，標準液濃度（x，μg/mL）為橫坐標作圖，獲得氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的線性方程、相關系數、線性范圍見表2。通過添加不斷稀釋的標準品到空白樣品，前處理方法同1.4，以信噪比（S/N）為3作為檢出限，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限分別為：0.01、0.02、0.02mg/kg。

表2 回歸方程與相關系數、線性范圍和檢出限Table 2 The regression equations，correlation coefficient，linear range and detection limits

2.5 方法回收率和精密度

在空白對蝦和羅非魚的肌肉樣品中，分別添加0.25、0.50、5.00mg/kg，3個濃度水平的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準品，每個濃度水平做5個平行實驗，計算這3種藥物的加標回收率和相對標準偏差（RSD）。結果表明，三種藥物在0.25、0.50和5.00mg/kg添加水平下平均回收率在81.00%～102.93%之間，RSD在1.95%～7.10%之間。說明本方法可以滿足水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測要求。方法回收率和相對標準偏差見表3。

圖3 對蝦空白樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of Shrimp blank sample

圖3表明，經過前處理的空白對蝦樣品在目標峰處沒有雜質峰的干擾，且雜質少，說明這種提取方法能夠有效的去除雜質的干擾。

圖4 對蝦加標樣品圖（5.00mg/kg）Fig.4 Chromatogram of Shrimp spiked sample（5.00mg/kg）

圖4表明三種氯霉素類藥物峰型和分離度較好，且無雜質峰的干擾，說明選擇的檢測條件能夠很好的檢測對蝦中氯霉素類藥物的殘留。

圖5 羅非魚空白樣品圖Fig.5 Chromatogram of Tilapia blank sample

圖5表明此方法對空白羅非魚的提取與凈化使雜質在2～4min被洗脫，能夠排除雜質干擾，說明此方法能夠很好的去除羅非魚中雜質對這三種氯霉素類藥物檢測的干擾。

圖6 羅非魚加標樣品圖（5.00mg/kg）Fig.6 Chromatogram of Tilapia spiked sample（5.00mg/kg）

表3 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的加標回收率和相對標準偏差Table 3 Recovery and RSD of CAP，TAP and FF

圖6表明三種氯霉素類藥物峰型和分離度較好，且能夠有效去除雜質干擾，說明這種方法能夠有效的提取和檢測羅非魚中氯霉素類藥物。

3 結論

建立了一種以梯度洗脫方式，雙波長同時檢測水產品中3種氯霉素類藥物殘留的HPLC－UVD法。以2%堿性乙酸乙酯為提取溶劑，超聲波提取，正己烷脫脂，帶紫外檢測器的高效液相色譜儀檢測。此方法前處理簡單、快捷，容易形成標準化操作，精密度高，重現性好，定性準確，滿足甲砜霉素和氟苯尼考殘留限量的檢測要求，同時也可以對氯霉素的殘留進行檢測，適合于大量水產品中氯霉素類藥物殘留的快速檢測和監控。

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Determination of residues of chloramphenicol，thiamphnicol and florfenicol in fishery products by HPLC-UVD

TAO Xin-chen1，HUANG He1，*，LI Zhi-qing2，GAO Ping2，LIAO Jian-meng2，HUANG Guo-fang2，LUO Lin2，CHEN Hong2
（1.Institute of Food Science and Technology of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China；
2.Zhanjiang Institute of Supervision＆Test on Quality＆Measure，Zhanjiang 524043，China）

A high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection method was developed for simultaneous determination of Chloramphenicol（CAP），Thiamphnicol（TAP）and Florfenicol（FF）in fishery products. Chloramphenicols（CAPs）residues were extracted by basic ethyl acetate，followed by sample cleanup with n-hexane and quantization by liquid chromatography with ultraviolet detector.Good linearities were obtained in the concentration ranging from 0.10～10.00mg/L for CAP，TAP and FF.The average recoveries and relative standard deviations（RSDs）for the analysis of all samples fortified over the range of 0.25～5.00mg/kg were in the range of 81.00%～102.93%and 1.95%～7.10%，respectively.The limits of detection were 0.01mg/kg for CAP and 0.02mg/kg for TAP and FF.

HPLC；chloramphenicol；thiamphnicol；florfenicol；fishery products；residue

ST207.5

A

1002－0306（2012）20－0080－04

2012－05－14 *通訊聯系人

陶昕晨（1988－），男，碩士研究生，主要從事食品質量與安全方面的研究。

湛江市財政資金科技專項項目（2011D02）。