槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機理

胡 靜，趙小慧，朱春玉，胡風慶，回 晶*

(遼寧大學生命科學院生物材料與生物制藥實驗室， 遼寧 沈陽 110036)

槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機理

胡 靜，趙小慧，朱春玉，胡風慶，回 晶*

(遼寧大學生命科學院生物材料與生物制藥實驗室， 遼寧 沈陽 110036)

通過測定槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌最低抑菌質量濃度和生長曲線，探討槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機理，同時利用掃描電鏡和透射電鏡觀察金黃色葡萄球菌顯微形態。結果表明：槐糖脂能有效抑制金黃色葡萄球菌生長，且抑制作用體現質量濃度依賴特性，最小抑菌質量濃度(MIC)為1.5625mg/mL。酸性和高溫條件不影響槐糖脂抑菌性，表明其具有很好的穩定性。電鏡結果表明，槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑制可能源于其對菌體細胞壁和細胞膜的破壞作用。

槐糖脂；抑菌；最小抑菌質量濃度；掃描電鏡；透射電鏡

槐糖脂是由球擬酵母屬(Torulopsis)和假絲酵母屬(Candida)的一些酵母菌產生的糖脂表面活性劑，由于其產量較高，具有很好的表面性能，并且低毒、生物可降解等很多優點，在食品、醫藥、石油、化工和環境修復等許多領域中得到了不同程度的應用[1]。現代研究表明槐糖脂具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗病毒[2-8]等多種生物活性。

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是一種可引起人類和動物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一[9]。本實驗基于槐糖脂的相關報道[3-6]，針對常見的病原細菌和植物病原菌，對槐糖脂的抑菌作用及在不同溫度和pH值條件下槐糖脂的穩定性進行研究，并針對槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機理進行探究，旨在為今后槐糖脂的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與培養基

槐糖脂：由假絲酵母菌(Candida bombicola)利用葡萄糖為底物發酵產生。發酵液經乙酸乙酯抽提后，減壓干燥，正己烷洗滌，干燥得到槐糖脂[10]。

病原細菌：大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、單增李斯特菌(Listeria monocytogene)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)為本實驗室保存。

植物病原菌：番茄葉霉病菌(Fulvia fulva)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、茄子黃萎病菌(Verticillium daliae) 沈陽農業大學植物病理系。

LB培養基：氯化鈉10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、瓊脂粉15g、水1000mL，pH7.0；PDA培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉20g、水1000mL，自然pH值。

1.2 儀器與設備

KYKY-EM3200數字化掃描電子顯微鏡 北京中科科儀技術發展有限責任公司；H-7650透射電鏡 日本日立公司。

1.3 菌株的培養條件

除特殊指出的影響因素以外，抑菌作用研究中所有條件均為菌體生長的最適條件，即細菌均采用LB培養基，E.coli，37℃；S.aureus，37℃；P.putida，30℃；L.monocytogenes，37℃[11]；植物病原菌均采用PDA培養基，28℃[12]。

1.4 槐糖脂對各供試菌株的抑菌作用

利用濾紙片法[13]和液體倍比稀釋法[14]對病原微生物的抑菌作用及最小抑菌質量濃度(MIC)進行測定。

1.5 pH值與溫度對槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌的影響

1.5.1 pH值

測定槐糖脂在3、4、5、6、7、8、9共7種不同pH值情況下對S.aureus的抑菌作用，以槐糖脂質量濃度為0時作為對照。

1.5.2 溫度

測定槐糖脂分別在60、100、120℃的條件下保溫30min后對S.aureus的抑菌作用，以未處理的樣品作對照[15]。

1.6 槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機理分析

1.6.1 對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

將S.aureus培養到對數生長期，分成實驗組和對照組。實驗組加入3.125mg/mL槐糖脂，之后與對照組同步繼續培養，用分光光度計檢測槐糖脂作用后S.aureu菌量的變化，繪制生長曲線[16]。

1.6.2 掃描及透射電鏡觀察

菌體制備同1.6.1節，設定藥物作用時間分別為4h和8h，取1.5mL樣品溶液，按掃描電鏡[17]及透射電鏡生物樣品制備法[18]制樣，在電鏡下觀察菌體外觀形態及超微結構。

2 結果與分析

2.1 槐糖脂對病原微生物的抑菌作用

從表1可以看出，槐糖脂對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和植物病原菌沒有抑制作用。對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌、單增李斯特菌具有較好的抑制作用，其中對S.aureus的抑菌作用最明顯，最低抑菌質量濃度為1.5625mg/mL。Yoo等[4]也報道了槐糖脂能夠強烈抑制革蘭氏陽性菌如Bacillus、Staphylococcus和Streptococcussp.的生長，但對大腸桿菌(Escherichia coli)的生長沒有抑制作用。這主要是由于細菌細胞壁組成及結構的差異，生物表面活性劑對革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌有更顯著的抑制作用[19]。

2.2 pH值和溫度對槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌的影響

2.2.1 pH值對槐糖脂抑菌作用的影響

槐糖脂是一種可降解的生物表面活性劑，具有較高的選擇性，其表面活性受極端溫度、pH值、鹽度等條件影響小[20]。如表2所示，槐糖脂對S.aureus的MIC表現為：酸性及中性情況抑菌作用穩定，堿性情況抑菌作用次之。分析其原因，可能是pH值呈堿性時改變了槐糖脂的結構。不同類型的槐糖脂有共同的結構特征，每個分子由親水性和疏水性兩部分構成，親水性部分是槐糖，疏水性部分是飽和或不飽和的長鏈ω-(或ω-1)羥基脂肪酸。區別在于它們所含脂肪酸碳鏈的長度不同、飽和程度不同、乙酰化程度不同以及是否存在內酯化作用[20]。當pH值呈堿性時，一方面有可能與脂肪酸形成酯，另一方面有可能使原有的內酯化作用破壞。因此，槐糖脂宜在酸性條件下使用，其抑菌pH值范圍為3～7。

表1 槐糖脂對不同病原微生物的抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of sophorolipids against different pathogenic microorganisms mm

表2 pH值對槐糖脂抑菌活性的影響Table 2 Effect of pH on antibacterial activity of sophorolipids against Staphylococcu aureus

2.2.2 溫度對槐糖脂抑菌作用的影響

表3 溫度對槐糖脂抑菌活性的影響Table 3 Effect of temperature on antibacterial activity of sophorolipids against Staphylococcu aureus

由表3可知，槐糖脂經不同溫度處理后接種的平板未見菌落長出，且與處理前樣品的最小抑菌質量濃度一樣。說明經熱處理后槐糖脂仍然具有很好的抑菌效果，表明槐糖脂具有良好的耐熱性，高溫處理并不改變槐糖脂的性質。

2.3 槐糖脂抑制金黃色葡萄球菌機理分析結果

2.3.1 槐糖脂對金黃色葡萄球菌生長的影響

圖1 槐糖脂對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig.1 Effect of the growth curve of sophorolipids against Staphylococcu aureus

如圖1所示，與正常S.aureus相比，當加入槐糖脂后其生長曲線明顯變化。正常S.aureus20h內呈正常生長曲線，實驗組不能形成生長曲線，且作用明顯。該對比生長曲線表明，槐糖脂主要抑制了S.aureus對數生長期的菌體分裂[21]。在細菌生長到對數生長期時加入槐糖脂，菌體數目顯著減少，并沒有達到正常的生長高峰，之后進入衰亡期，其菌量僅達到了正常生長菌的1/4。

2.3.2 槐糖脂對金黃色葡萄球菌超微結構的影響

圖2 掃描和透射電鏡下金黃色葡萄球菌的形態結構Fig.2 Morphology of S. aureus examined by scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM)

細胞超微結構的觀察是研究抑菌機理不可缺少的直接證據。掃描電鏡下觀察，正常的S.aureus細胞表面光滑、圓潤，呈球狀，細胞與細胞間界限分明，細胞排列呈明顯的葡萄串狀(圖2A)，與文獻報道一致[22]。經槐糖脂處理4h后，金黃色葡萄球菌的排列變得松散，無規律，不能聚集成葡萄狀(圖2B)。經槐糖脂處理8h后，細胞間的界限略變模糊，部分菌體發生結團現象(圖2C)。細胞間的界限變模糊，說明部分菌體細胞壁已經被破壞，細胞壁的降解物多糖類物質在菌體細胞附近聚集，從而使細胞黏結成團塊狀。

透射電鏡下觀察，正常的S.aureus菌體飽滿近圓形，邊緣清晰，細胞質分布均勻(圖2D)。經槐糖脂處理4h后的菌體，菌體有些變形，位于細胞膜區出現一些小的空泡(圖2E)。經槐糖脂處理8h后，金黃色葡萄球菌細胞質固縮，空腔增大，細胞質內出現許多空腔，細胞嚴重受損(圖2F)。這表明，槐糖脂能夠導致S. aureus細胞質固縮，形成空洞，細胞代謝無法正常進行，最終導致菌體死亡。

3 結 論

抑菌實驗表明槐糖脂對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和植物病原菌沒有抑制作用。對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌、單增李斯特菌具有較好的抑制作用，其中金黃色葡萄球菌的作用最明顯，最低抑菌質量濃度為1.5625mg/mL。槐糖脂的最佳抑菌pH值范圍為3～7，且熱穩定性良好。

槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機理實驗表明，槐糖脂抑菌主要是在細菌的對數生長期，經槐糖脂作用后的菌體出現細胞質固縮、凝集成塊，出現空腔等現象，說明菌體細胞膜和細胞壁被破壞是槐糖脂抑菌的機理之一。

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Inhibitory Effect and Mechanisms of Sophorolipids againstStaphyloccocus aureus

HU Jing，ZHAO Xiao-hui，ZHU Chun-yu，HU Feng-qing，HUI Jing*
(Laboratory of Biomaterials and Biopharmaceuticals, School of Life Sciences, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

To explore antibacterial mechanisms of sophorolipids againstStaphylococcus aureus, the minimum inhibitory concentration (MIC) of sophorolipids againstS. aureusand the growth curves ofS. aureuswere determined. The microscopic structure ofS. aureuswas observed through scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM). Results showed that sophorolipids effectively inhibited the growth ofS.aureus. The inhibitory effect of sophorolipids was a concentration-depended mode, and the MIC of sophorolipids was 1.5625 mg/mL. However, the inhibitory effect of sophorolipids was stable at acid and high temperature condition, indicating that it had excellent stability. Furthermore, sophorolipids should pay antibacterial role through destroying cell membrane and cell wall according to SEM and TEM.

sophorolipids；antibacterial；MIC；scanning electron microscope (SEM)；transmission electron microscope (TEM)

Q935

A

1002-6630(2012)05-0033-04

2011-03-14

沈陽市發展與改革委員會高技術研發基金項目(2010-16)；遼寧省教育廳科學基金項目(L2010150)；遼寧大學青年基金項目(2009LDQN25)

胡靜(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為微生物學。E-mail：hujing628@163.com

*通信作者：回晶(1977—)，女，講師，博士研究生，研究方向為生物制藥與生物材料。E-mail：huijing@lnu.edu.cn