花果山“糯米茶”中黃酮化合物的分離純化及活性研究

胡喜蘭，姜 琴，尹福軍，劉 濤

(淮海工學院化學工程學院，江蘇 連云港 222005)

花果山“糯米茶”中黃酮化合物的分離純化及活性研究

胡喜蘭，姜 琴，尹福軍，劉 濤

(淮海工學院化學工程學院，江蘇 連云港 222005)

利用溶劑提取法對花果山“糯米茶”中的黃酮化合物進行提取，并利用硅膠柱色譜分離法對其進行分離純化，同時通過DPPH抗氧化活性體外評價體系測定其清除自由基的能力。結果顯示，“糯米茶”中的黃酮化合物具有一定的的清除DPPH自由基的能力，“糯米茶”是可開發的抗衰老、抗氧化的保健茶。

糯米茶；黃酮化合物；提取；活性

流蘇，是連云港市云臺山脈的特有樹種，是珍貴的綠化樹種，又是制作盆景的好材料。春天采其嫩葉，陰干，制成茶稱為“糯米茶”。用其花制茶稱為“糯米花茶”，清香爽口，別具一番風味，它們的藥理作用多樣，化學成分復雜，民間還常用糯米茶消積食，清內火，有明目之功能，茶渣可治胃病和小兒腹瀉，具有藥用價值[1]。目前國內對其有效成分的研究尚未見報道，所以研究和開發“糯米茶”的有效成分是很有必要的。本課題組選擇連云港特有的“糯米茶”進行研究，測定了礦物元素、茶多酚、黃酮化合物和多糖的含量[2]，利用溶劑提取法對糯米茶中的黃酮化合物進行提取，并利用層析法對其進行分離純化，同時通過DPPH自由基抗氧化活性體外評價體系測定其清除自由基的能力，為其綜合應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花果山“糯米茶”由江蘇連云港康緣大藥房吳舟中藥師提供。用前將其置于烘箱中，55℃條件下干燥恒質量后粉碎，過40目篩，保存于磨口瓶中并置于干燥避光處，備用。

蘆丁標準品 南京替斯艾么中藥研究所；槲皮素、山奈酚標準品 中國藥品生物制品鑒定所；異鼠李素標準品 美國 BioChemika公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma Aldrich公司；VC、合成抗氧化劑叔丁基對苯二酚(TBHQ)、無水甲醇(色譜純)、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、無水甲醇、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

WFZ-2000型紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱 鄄城華魯儀器有限公司；RE52CS旋轉蒸發儀 浙江舟山市定海區海源儀器廠；B-220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；ZFI型四用紫外分析儀 上海顧村電光儀器廠；UV-2550紫外分光光度計、LC-10ADVP型高壓液相色譜儀、CLASS-VP工作站、SPD-M10AVP二極陣列檢測器 日本島津公司；X-4顯微熔點儀 上海精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮化合物的提取

將“糯米茶”研磨、過40目篩，各取20g于20mL燒瓶中，加入約10倍的80%乙醇溶液于80℃水浴鍋中進行溶劑提取1.5h，重復3次，將濾液進行減壓抽濾，合并濾液。將所獲得的濾液移入梨形瓶，進行濃縮。濃縮后的物質因黏于梨形瓶壁，所以使用餾分將其全部溶解轉移入50mL燒杯，并將燒杯用保鮮膜封口，并戳幾個小洞，使小瓶中的溶液揮干，而又不被污染，得粗提物，備用[3-4]。

1.3.2 黃酮化合物的分離、純化

利用硅膠柱色譜分離[5-8]，采取濕法裝柱，干法上樣，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、50%的乙醇溶液對粗提物進行洗脫，至溶液基本無色，將所獲得的洗脫液進行濃縮，濃縮后的物質因黏于瓶壁，所以使用餾分將其全部溶解轉移至50mL燒杯中，用保鮮膜封口，并戳幾個小洞眼，使瓶中的溶劑揮干，共收集得到A、B、C、D、E、F、G7個樣品。

1.3.3 薄層色譜(TCL)檢測

首先進行展開劑條件摸索，把上述樣品用毛細管蘸取液體按一定順序點在硅膠板上，放置層析缸跑板。而層析缸中依次為乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(體積比8:2)、乙酸乙酯-甲醇(體積比6:4)、乙酸乙酯-甲醇(體積比2:8)、甲醇、甲醇-水(體積比8:2)、甲醇-水(體積比6:4)溶液量為10mL。一般約經30～40min，跑板結束，在紫外燈下清楚可見跑板情況，觀察其是否有拖尾或含其他雜質等現象。

1.3.4 熔點測定

將樣品進行重結晶，對析出的產品進行熔點測定，并與常見的黃酮化合物標準品，如蘆丁(rutin)、槲皮素(quercetrin)、山奈酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)對比。

1.3.5 高效液相色譜檢測

設置條件為：壓力：0～40MPa；顯示精度：±2%；流速：1mL/min；進樣體積：20μL；操作溫度：4～35℃；流動相：甲醇(色譜純)；波長：360nm；取少量樣品于小瓶內，將其溶劑揮干后，用適量甲醇溶解，待用[9]。

1.3.6 樣品的抗氧化活性測定

采用DPPH自由基法測定。準確稱取DPPH自由基，配制質量濃度為0.049mg/mL的DPPH自由基-乙醇溶液。以乙醇為溶劑，配制不同質量濃度的樣品溶液，分別取0.1mL樣品溶液，加入3.9mL質量濃度為2.5mg/100mL DPPH自由基-乙醇溶液，以乙醇替代樣液為空白掃基線。將混合溶液搖勻，用比色皿，在515nm波長處測定其在不同時間的吸光度，根據下式計算DPPH自由基清除率[10-15]。

式中：AT為自由基清除過程中某一時刻DPPH自由基的吸光度；A0為以乙醇替代樣品溶液的DPPH自由基的吸光度。

2 結果與分析

2.1 黃酮化合物的分離、純化

石油醚洗脫過程中未發現洗脫液有顏色變化，僅在柱上端有黃色柱段出現，但一段時間沒有位移，改換乙酸乙酯，有灰綠色物質洗出，用接收瓶A收集；洗脫液變淺發黃時，用接收瓶B收集；當柱內的有顏色部位基本沒有位移時，換乙醇進行洗脫，用吸收瓶C收集；當有深綠色物質洗出時，用吸收瓶D收集；當洗脫液變淺時，用吸收瓶E收集；當有黃色物質洗出時，用吸收瓶F吸收；在柱內的有顏色部位基本沒有位移時，用50%的乙醇溶液洗脫，由收集瓶G收集。A、C、D中溶劑揮干后基本沒有產品，故對樣品B、E、F、G進行薄層色譜檢測。

2.2 TCL檢測結果

圖1 樣品B、E、F、G在不同展開劑中的薄層色譜圖Fig.1 TCL spectra of samples B, E, F and G in different mobile phases

由圖1可知，甲醇的展開效果最好，即適用純甲醇做展開劑最佳，故高效液相色譜選用甲醇作為流動相。硅膠柱色譜得到的樣品B、E較多，有一定的研究價值，故與標準品蘆丁(R)、槲皮素(Q)、山奈酚(K)、異鼠李素(I)進行TCL對比，為防止各樣品發生拖尾現象，更好地分離區別開樣品B和E，選用甲醇中加入甲酸作為展開劑，甲醇-甲酸(體積比9:1)10mL做進一步展開劑[6]，結果見圖2。

圖2 樣品B、E、R、Q、K、I的薄層色譜圖Fig.2 TCL spectra of samples B, E, R, K and I

由圖2可知，樣品E拖尾較長，可能不是純化合物，還需進一步的純化，樣品B可能是蘆丁(R)、槲皮素(Q)、山奈酚(K)、異鼠李素(I)中的一種，故對其熔點進行測定。

2.3 熔點測定結果

樣品B在甲醇中結晶，析出淺黃色的粉末，其熔點為263～266℃，與幾種標準品的熔點比較，相差較大，說明樣品B不是上述幾種標準品之一的產物。通過紫外譜圖查證，結合熔點，初步判斷B與7-羥基-4′-甲氧基異黃酮(C16H12O4)，熔點為263～264℃(甲醇中重結晶)，與芒柄花黃素有相似之處，但確認還需要對樣品進行進一步的純化分離，并利用相關質譜、氫譜、碳譜等進行表征，進一步的研究有待進行。

2.4 高效液相色譜檢測結果

圖3 粗提物(a)、樣品B(b)、樣品E(c)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC spectra of crude extracts and samples B and E

由圖3可知，粗提物在6min左右有兩個明顯的峰，且相互交融，經過柱色譜分離，從粗提物中分離出了兩種黃酮化合物B和E，且通過峰面積計算，B的相對含量為99.72%，E的相對含量為99.54%。因樣品B含量較樣品E高，故下面選擇樣品B進行抗氧化活性測定。

2.5 清除 DPPH 自由基的能力

利用 DPPH的褪色效應，測定不同質量濃度的樣品B在不同時間的吸光度，同時與0.56mg/mL VC及合成抗氧化劑TBHQ(0.55mg/mL)比較，計算不同質量濃度樣品B溶液對DPPH自由基的清除率，結果見圖4。

圖4 不同質量濃度樣品B對DPPH自由基的清除作用Fig.4 DPPH radical scavenging ability of VE, TBHQ and flavonoids from glutinous rice tea

由圖4可知，在加入不同質量濃度樣品B后，DPPH自由基的清除作用隨著樣品B質量濃度的增加而增大，且隨著時間的推移，DPPH自由基的清除作用也在慢慢增加，其自由基的清除作用雖沒有VC、TBHQ的強烈，但也具有一定的作用。

3 結 論

由于黃酮化合物酚羥基中的鄰位酚羥基極易被氧化，且對活性氧等自由基有較強的捕捉能力，使黃酮化合物具有一定的抗氧化性和清除自由基的能力，而實驗結果表明，“糯米茶”中含有的一定量的黃酮化合物，并具有一定的的清除 DPPH自由基的能力，說明“糯米茶”具有一定的體外抗氧化活性，可開發為抗衰老、抗氧化的保健茶。

[1] 吳舟. 云臺山植物名錄[M]. 北京: 植物文獻社, 2001: 28.

[2] 胡喜蘭, 姜琴, 尹福軍, 等. 花果山 糯米茶,,和 糯米花茶,,中有效成分的提取與測定[J]. 食品科學, 2010, 31(18): 112-115.

[3] 胡喜蘭, 韓照祥, 陶瑩, 等. DPPH·法測定多種植物的抗氧化活性[J]. 食品科技, 2006, 180(10): 264-268.

[4] 張勇, 李彩霞, 李鵬, 等. 醇法提取鎖陽中總黃酮的研究[J]. 甘肅科學學報, 2005, 17(7): 41-43.

[5] 馬鶯, 王靜, 牛天嬌. 功能性食品活性成分測定[M]. 北京: 化學工業出版社, 2005: 258-259.

[6] 盧艷花. 中藥有效成分提取分離技術[M]. 北京: 化學工業出版社, 2005: 33-36.

[7] 黃文哲, 段金廒, 李正亮. 懷槐的化學成分研究Ⅰ[J]. 中國藥科大學學報, 2000, 31(1): 8-10.

[8] 林啟壽. 中草藥成分化學[M]. 北京: 科學出版社, 1977: 343-344.

[9] 何麗一. 平面色譜方法及應用[M]. 北京: 化學工業出版社, 1999: 43-48.

[10] 郭亞力, 李聰, 歐靈澄, 等. 槐米中天然抗氧化劑的提取及其抗自由基性能研究[J]. 食品科學, 2004, 25(7): 154-157.

[11] 李紅, 張元湖．應用DPPH·法測定蘋果提取物的抗氧化能力[J].山東農業大學學報: 自然科學版, 2005, 36(1): 35-38.

[12] NEGI P S, JAYAPRAKASHA G K, JENA B S. Antioxidant and antimutageni activities of pomegranate[J]. Food Chemisty, 2003, 80: 393-397.

[13] 黃海蘭, 王國明, 李增新, 等. 鴨跖草抗氧化成分提取及其活性研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 55-58.

[14] 柳建軍, 許立松, 王菁菁, 等. 黃連木嫩葉抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 45-47.

[15] 胡喜蘭, 尹福軍, 程青芳, 等. 不同花期芍藥花中活性成分的研究[J].食品科學, 2008, 29(9): 511-514.

Extraction and Activity of Flavonoids from Glutinous Rice Tea Grown in Huaguo Mountain

HU Xi-lan，JIANG Qin，YIN Fu-jun，LIU Tao
(College of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Flavonoids were extracted from glutinous rice tea grown in Huaguo Mountain by solvent extraction and isolated by column chromatography on silica gel. The antioxidant activityin vitrowas determined by DPPH free radical scavenging assay. The results indicated that flavonoids from glutinous rice tea had certain free radical scavenging ability. In conclusion, glutinous rice tea has the potential to be developed as an anti-aging and antioxidant health-care tea.

glutinous rice tea；flavonoids；extraction；activity

R284

A

1002-6630(2012)05-0106-03

2011-09-26

連云港市自然科學基金項目(CG0806)；淮海工學院引進人才啟動基金項目(KK01060)

胡喜蘭(1961—)，女，教授，學士，研究方向為配位化學和天然藥物化學的提取及應用。E-mail：huxilan@hhit.edu.cn