旱生植物內生細菌的分離及耐旱菌株的篩選鑒定

張彥濤，生吉萍,2，葛 佳，矯玉翠，王正榮，程凡升，申 琳,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國人民大學農業與農村發展學院，北京 100872)

旱生植物內生細菌的分離及耐旱菌株的篩選鑒定

張彥濤1，生吉萍1,2，葛 佳1，矯玉翠1，王正榮1，程凡升1，申 琳1,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國人民大學農業與農村發展學院，北京 100872)

為篩選耐旱內生細菌，并對其進行鑒定，以典型耐旱植物為材料，分離純化出142株內生細菌。采用液體培養基中添加聚乙二醇6000降低滲透勢的方法分析內生細菌的耐旱情況。從中篩選出1株能夠耐受質量濃度為60g/100mL聚乙二醇6000的內生細菌PB14。對該菌株進行形態學觀察，生理生化和16S rDNA序列鑒定，判定菌株PB14為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

耐旱；內生細菌；鑒定；蠟樣芽孢桿菌

植物內生菌(endophyte)是指在其生活史的一部分或其整個生活史，生活于健康植物組織內部、不引發植物產生明顯病癥的微生物，包括內生真菌、內生細菌和內生放線菌等[1]。植物內生細菌幾乎存在于所有植物體內，而且同一植物體內往往含有多種內生細菌，其多樣性極其廣泛。到目前為止，已經分離鑒定的內生細菌已達50多個屬[2]，植物內生菌成為我國當前微生物研究領域的熱點[3]。植物內生細菌長期生活在植物體內并與植物協同進化。一方面，植物體為其提供生長必需的能量和營養；另一方面，內生細菌又可通過自身的代謝產物或借助于信號傳導作用對植物體產生影響。植物內生細菌作為植物微生態系統中的天然組成成分，其存在對加強植物對環境的適應性具有重要的意義[4-5]。

“民以食為天”，隨著全球性的氣候異常和生態平衡的破壞，土地日趨沙漠化，水資源短缺成為全人類面臨的嚴重生態問題，干旱已成為制約農業生產發展的關鍵因素。因此，作物耐旱性的研究顯得尤為重要。近年來，對于耐旱作物的研究已經取得一定的成效，主要包括雜交育種[6]、基因工程[7]等手段。由于雜交育種所需時間長，基因工程的安全性等問題，利用優良耐旱微生物來提高植物的抗旱能力越來越受到人們的關注。動植物是食品加工的基本原料，植物耐旱性能的提高可擴大植物的應用范圍，實現原料新品種的開發與增產，既豐富了食品原料的多樣性，又改善和提高了食品資源的品質特性等[8]。本研究從典型耐旱植物中篩選能夠耐受質量濃度為60g/100mL聚乙二醇6000 (PEG6000)的內生細菌，并通過常規方法和分子生物學的方法對菌株進行鑒定，以豐富耐旱微生物資源，提高作物耐旱性能，為食品資源的改造提供一定的科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

白蠟、茅草、射干、羅布麻、蓼草、胡楊、怪柳采自山東省東營市永安機場；大蕓、梭梭、沙果、紅柳、核桃采自新疆和田；蓮子采自山東青島。

75%乙醇消毒液 德州安捷高科消毒制品有限公司；次氯酸鈉溶液(有效氯含量≥8%)、聚乙二醇6000 (PEG6000) 西隴化工股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；API50CHB碳水化合物鑒定試劑條 法國生物梅里埃公司。

分離培養基：營養瓊脂(NA)配方為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂粉15～20g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4；篩選培養基：營養肉湯(NB)配方為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4，PEG6000根據需要添加；API50CHB培養基 法國生物梅里埃公司。

1.2 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；DYY-6C瓊脂糖核酸電泳 北京六一儀器廠；GL212全自動凝膠成像系統 美國Kodak公司；PB-10酸度計 德國Sartorius公司；UV-1800紫外-可見光分光光度計 日本島津制作所。

1.3 方法

1.3.1 內生細菌的分離純化和保藏

采用組織研磨法對典型旱生植物內生細菌進行分離[9]。取采集的新鮮樣品，用蒸餾水將植物表面洗凈，稍干后分別取其根、莖、葉，在75%乙醇消毒液中浸泡3～5min，3%次氯酸鈉浸泡5min，75%乙醇浸泡5min。最后用無菌水沖洗3～4次，最后一次沖洗的無菌水涂布平板做空白對照。將樣品在滅菌的研缽中研磨，加適量無菌生理鹽水研磨至勻漿狀。取1mL液體分別按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀釋，并分別涂布平板，37℃恒溫培養2d。若對照處理的分離培養基平板上無菌落出現，表明植物材料表面消毒徹底，分離到的是內生細菌。挑取單菌落轉移至新的培養基平板上，劃線法純化，純化好的菌株于－80℃冰箱保藏。

1.3.2 耐旱內生菌株的篩選

利用PEG6000人工模擬干旱條件[10]，將初篩得到的菌株接種于含有不同質量濃度PEG6000的營養肉湯培養基中，37℃、170r/min搖床培養1～4d，檢測培養液的光密度值(OD600nm)。分析菌株在不同質量濃度PEG6000中的生長情況。

1.3.3 菌株生理生化特性

1.3.3.1 菌株形態

將實驗菌株在NA培養基平板上劃線分離，37℃培養48h，觀察菌落形態；用接種環挑取單個菌落涂片，進行革蘭氏染色和芽孢染色，用顯微鏡觀察菌體形態[10]。

1.3.3.2 菌株最適培養條件

將篩選所得菌株以2%的接種量接種于NB培養基中，分別置于25、28、32、35、37、40℃條件下，170r/min搖床培養2d。定期測定培養液的 OD600nm，確定最適培養溫度。

配制一系列pH3、4、5、6、7、8、9的NB培養基，按2%的接種量于最適溫度條件下，170r/min搖床培養2d。定期測定培養液的OD600nm確定最適pH值。

1.3.3.3 菌株生理生化特性鑒定

采用API50CH試劑條和API50CHB培養基進行49種碳水化合物的發酵實驗。純化的菌株按要求配成一定濁度的懸浮液，按試劑盒說明加入到API50CHB培養液中，混勻后加入到0～49號反應凹槽內，35℃培養。0號為陰性對照。

1.3.4 菌株的16S rDNA 分子生物學鑒定及系統發育樹構建

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組，采用16S rDNA通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3＇)和1492R(5＇-GGCTACCTTGTTACGACTT-3＇)進行PCR擴增。PCR反應體系：DNA模板2μL，dNTP Mixture 25μL，引物27F與引物1492R各1μL，ddH2O 21μL。反應條件：94℃預熱5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，33個循環；72℃終延伸10min。PCR產物5μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物由北京六合華大基因科技股份有限公司完成測序。

登陸GeneBank數據庫，將同源性相近的序列通過ClustalW軟件進行聚類分析，使用MEGA 4.0軟件以Neighbor-Joining計算方式生成系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離和純化

為了研究植物體內內生細菌的耐旱情況，對13種植物體內的內生細菌進行分離和純化，根據NA培養基上的菌落顏色和形態差異，得到142株內生細菌(表1)。結果表明，在干旱環境下的植物體內共存著不同種類的內生細菌。

2.2 內生細菌耐旱情況分析

圖1 內生細菌耐旱性分析Fig.1 Drought-tolerant analysis of endophytic bacteria

根據菌株在不同質量濃度PEG6000的NB培養基中OD600nm的大小進行耐旱性分析，結果如圖1所示，篩選得到的142株內生細菌均有一定的耐旱性。所有菌株均能夠耐受20g/100mL的PEG6000；其中，136株能夠耐受30g/100mL的PEG6000，占所有菌數的95.8%；67株能夠耐受40g/100mL的PEG6000，占所有菌數的47.2%；7株能夠耐受50g/100mL的PEG6000，占所有菌數的4.9%；2株能夠耐受60g/100mL的PEG6000，占所有菌數的1.4%，選擇其中一株PB14菌株進行進一步研究。

圖2 不同質量濃度的PEG6000對菌株PB14生長的影響Fig.2 Effect of PEG6000 on the growth of PB14

菌株PB14分離于白蠟葉片，其在含有不同質量濃度PEG6000的NB培養基中的生長情況如圖2所示。菌株在質量濃度為10～30g/100mL的PEG6000培養基中都能很好地生長。當質量濃度為40g/100mL時，菌株生長受到一定的影響，當質量濃度在50～60g/100mL范圍內時菌株生長受到較大抑制。

2.3 菌株生理生化特性

2.3.1 菌株形態

菌株PB14在NA培養基上生長良好，37℃培養20h后，即可以形成明顯的菌落，菌落直徑約為2mm。菌落呈圓形，不透明，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，長時間培養可以產生黃褐色色素。革蘭氏染色后在10×100顯微鏡下觀察細胞呈短直桿狀，革蘭氏陽性菌，芽孢染色后呈橢圓形，見圖3。

圖3 菌株PB14菌落形態、革蘭氏染色及芽孢染色結果Fig.3 Morphological characteristics of strain PB14

2.3.2 菌株最適培養條件

圖4 菌株PB14在不同溫度條件下的生長情況Fig.4 Growth of PB14 strain at different temperatures

如圖4所示，菌株PB14在25～40℃均能良好生長，最適溫度為35℃；如圖5所示，菌株PB14在pH5～8范圍內生長良好，最適pH值為6。

圖5 菌株PB14在不同pH值培養基中的生長情況Fig.5 Growth of PB14 strain at different pH

2.3.3 菌株生理生化特性鑒定結果

表2 菌株PB14部分生理生化特性鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identification of strain PB14

菌株PB14生理生化實驗結果見表2，結合API50CHB試劑條結果(表3)與《常見細菌鑒定手冊》[11]初步確定該菌為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

表 3 菌株PB14的API50CHB試劑條結果Table 3 API50CHB fermentation results of strain PB14

2.3.4 基于16S rDNA的分子生物學鑒定

將菌株PB14的16S rDNA的PCR擴增產物送樣測序后，得到其序列長度14472bp。使用Blastn在GeneBank基因庫中進行同源性搜索，并通過相似性比對，發現菌株PB14與蠟樣芽孢桿菌的相似度達到99% 以上，進一步確定該菌為蠟樣芽孢桿菌。從GeneBank中選擇11株菌的16S rDNA 基因序列，使用MEGA 4.0軟件進行多重比較，構建的系統發育樹見圖6。

圖6 基于16S rDNA基因序列的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of the isolate and sequences of relating species

3 結 論

本實驗從典型耐旱植物各器官中分離純化出內生細菌142株，利用NA液體培養基中添加PEG6000來降低滲透勢的方法對其耐旱性進行分析，最終篩選得到兩株能夠耐受60g/100mL PEG6000的內生細菌。對其中一株PB14進行分子生物學16S rDNA鑒定，并結合生理生化實驗結果，鑒定該菌株是一株蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

本結果表明，典型耐旱植物宿主中分離出的內生細菌都具有一定的耐旱能力。黃明勇等[12]在摸擬干旱條件下，對分離自金沙江干熱河谷區45株土著花生根瘤菌進行耐旱性鑒定分析，結果顯示供試菌株耐旱能力呈現多樣性特征。根瘤菌的這種對干旱環境表現出的不同反應，不僅與其本身對干旱條件的耐受力有關，與生長的環境也有很大的相關性，同內生菌一樣也是一種協同進化的反應[13]。Forchetti等[14-15]研究發現利用從干旱土壤的向日葵根際分離出的細菌處理向日葵種子能夠增加向日葵幼苗的耐旱性。在我國用叢枝菌根真菌提高柑橘的耐旱性已有報道[16]，然而對于利用內生細菌提高植物耐旱性的報道較少。本實驗從典型干旱植物體內分離篩選出耐旱內生細菌，拓寬了內生細菌資源的應用范圍和利用價值，可為增強植物耐旱性、擴大植物應用范圍、豐富食品資源及改善其品質特性等提供新的思路。

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Isolation and Identification of Drought-tolerant Bacteria from Xerophtes

ZHANG Yan-tao1，SHENG Ji-ping1,2，GE Jia1，JIAO Yu-cui1，WANG Zheng-rong1，CHENG Fan-sheng1，SHEN Lin1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. School of Agricultural Economics and Rural Development, Renmin University of China, Beijing 100872, China)

Drought-tolerant bacteria were isolated and identified in this paper. One hundred and forty two bacterial strains were isolated from the typical drought-tolerant plants. Through adding polyglycol 6000 (PEG6000) to the fluid nutrient medium for decreasing osmotic potential, the drought tolerance of endophytic bacteria were analyzed. One of these strains, PB14, has the capability of drought resistance up to 60 g/100 mL PEG6000. This strain was identified asBacillus cereusbased on morphological and biochemical experiments as well as 16S rDNA sequence analysis.

drought tolerance；endophytic bacteria；identification；Bacillus cereus

TS201.3

A

1002-6630(2012)05-0124-05

2011-03-30

國家公益性行業(農業)科研專項(200803033)

張彥濤(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：zyt_ly008@126.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，研究方向為農副產品綜合利用。E-mail：shen5000@gmail.com