抗瓜果腐霉芽孢桿菌優良菌株的篩選及生物學特性

張 旭，尚 楠，張 寶，張志剛，尚慶茂,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

抗瓜果腐霉芽孢桿菌優良菌株的篩選及生物學特性

張 旭1，尚 楠1，張 寶1，張志剛2，尚慶茂2,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

為獲得具有高效抗菌活性的芽孢桿菌用于生物防治與果蔬保鮮，從檸檬、葡萄、紅棗、酸奶、腐乳、豆瓣醬、哈爾濱紅腸等26種食品樣品中分離獲得204株芽孢桿菌，通過對峙培養法，初篩得到62株抗瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的菌株，選取其中抑菌效果明顯的4株菌株，采用牛津杯擴散法經復篩得到1株顯著抗瓜果腐霉的芽孢桿菌L-NM62，其發酵上清液對瓜果腐霉的抑菌圈直徑達到(24.54±0.13)mm。菌株L-NM62經形態學、生理生化和16S rDNA序列分析，被鑒定為枯草芽孢桿菌L-NM62(Bacillus subtilisL-NM62)。進一步研究枯草芽孢桿菌L-NM62的生物學特性，發現該菌株的最適生長溫度37℃，最適pH值7.5，最適接種量1.0%，并測定了該條件下枯草芽孢桿菌L-NM62的生長曲線。在此基礎上，考察枯草芽孢桿菌L-NM62的抗菌譜，結果表明，枯草芽孢桿菌L-NM62具有廣譜的抗菌活性，尤其對霉菌具有高效廣譜的抗菌效果，顯示出了很好的潛在開發應用前景。

枯草芽孢桿菌；瓜果腐霉；篩選；抑菌；生物學特性

瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)是重要的植物病原真菌之一，能引起各類農作物腐爛、猝倒等癥狀，在苗期發病尤為嚴重，常造成大量死苗。瓜果腐霉可通過其游動孢子對采后果蔬產生毒害作用[1]，導致果實腐敗。在貯藏期間，其菌絲可以通過病果和健康果實接觸而傳染，病菌侵入果皮后，在運輸、貯存的過程中，遇到合適條件時，就通過水果的傷口侵入果肉，最終導致果實腐爛潰敗，失去使用價值[2]。在防治采后果蔬腐敗的問題上，化學農藥應用歷史最為悠久，且效果明顯應用廣泛。但由于化學保鮮劑、防腐劑在應用過程中，常引起環境污染、殘留量較高[3-5]等安全性問題，因而開發高效、廣譜、天然的生物抗菌劑受到廣泛關注。天然抗菌劑的來源主要是從植物、動物和微生物資源中獲取[6]。

生物控制中的微生物稱為生防微生物[7-8]，微生物相對于植物和動物，具有生長周期短、代謝產物量大、不受季節限制的特點，因而成為生物殺菌劑的研究重點。其中芽孢桿菌的抑菌物質研究相對較多，芽孢桿菌具有營養要求簡單，抗逆性強，可以同時產生一種或多種抑菌物質，抑菌譜廣泛和抑菌效果好的特點[9]。近年來芽孢桿菌的生防作用在國內外得到普遍認可，在控制柑橘瓜果腐霉病、綠霉病、蒂腐病[10-11]及櫻桃褐腐病等果蔬病害中得到廣泛應用。因此，尋找來源廣泛、高效安全、抑菌譜廣的芽孢桿菌，在開發安全、高效、環保的生物防腐保鮮劑中十分重要。本實驗通過對峙培養法初篩，牛津杯礦散法復篩，篩選出1株對瓜果腐霉有拮抗作用的芽孢桿菌，并對其生理生化特性進行研究，以便其更好地應用于生物防治領域。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與培養基

樣品(市售)：酸奶、紅糖、芒果、魚豆腐、小米、茉莉花茶、紅棗干、奶粉、油炸蝦、海帶、咸鴨蛋、普洱茶、蜂王漿、水果糖、葡萄渣、米酒、炒栗子、豆腐乳、醬油、檸檬、柚子、豆瓣醬、榨菜、龍眼、白菜、哈爾濱紅腸。

菌種：L-NM62菌株為本實驗分離篩選獲得；瓜果腐霉ACCC37383(Pythium aphanidermatumACCC37383)中國農業微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉AS3.2915 (Aspergillus nigerAS3.2915)、總狀毛霉AS3.4941(Mucor racemosusAS3.4941)、黑根霉AS3.4997(Rhizopus nigricansAS3.4997)、白地霉AS2.1062(Geotrichum candidumAS2.1062)、赭曲霉AS3.3931(Aspergillus ochraceusAS3.3931)、赤散囊菌AS3.3551(Eurotium rubrumAS3.3551) 中國科學院微生物菌種保藏中心；金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、鏈球菌(Streptococcus)、假單胞菌(Pseudomonadaceae)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、大腸桿菌(E. coli)、白色念珠菌(Monilia albican)、單增李斯特氏菌1/2a (Listeria monocytogenes1/2a)、單增李斯特氏菌4b (Listeria monocytogenes4b)、灰霉(Botrytis cinerea)本實驗室保存菌種。

LB培養基、PDA培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司。

PCR反應用各種試劑 上海英駿生物技術有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設備

DNP-9802型電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；SCL-1300型垂直流潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司；TC512型PCR儀 美國Barloworld Scientific公司；TH500梯度混合器 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離

取1g樣品用無菌研缽研碎并加入到9mL無菌生理鹽水中，充分振蕩，80℃水浴15min，用無菌生理鹽水梯度稀釋后吸取0.1mL涂布LB平板，37℃培養24～72h，挑取單菌落劃線純化。對已純化菌株革蘭氏染色后鏡檢，確認產生芽孢后保存待用[9]。

1.3.2 抗瓜果腐霉芽孢桿菌的篩選

瓜果腐霉的培養：將瓜果腐霉接入PDA平板，28℃培養3～4d，直到菌絲布滿整個平板，4℃保存待用。

抗瓜果腐霉芽孢桿菌優良菌株的初篩：將熔化的PDA培養基倒入培養皿中，待培養基凝固后，從平板中心出發畫十字形，PDA平板的中央掐塊接入瓜果腐霉菌餅(直徑5mm)，距菌餅中心25mm處點種芽孢桿菌菌株，每個實驗設3個重復，37℃培養8h后，28℃培養3d，觀察芽孢桿菌菌落周圍是否存在抑菌圈并用十字測量法測量芽孢桿菌菌落直徑及其產生的抑菌圈直徑[12]。

抗瓜果腐霉芽孢桿菌優良菌株的復篩：將初篩出的抗菌效果好的芽孢桿菌菌株，接種于裝有30mL LB液體培養基的250mL三角瓶中，置于恒溫振蕩器中，28℃、140r/min培養48h。發酵液經10000r/min離心15min取得上清液，測定該發酵上清液的抗菌活性。

發酵液抗菌活性的測定：采用杯碟法，用雙層平板。底層：在無菌平皿中加入5mL PDA培養基，靜置冷卻凝固。上層：將PDA培養基分裝成15mL/管滅菌，熔化后倒入無菌平皿中，待培養基凝固后，瓜果腐霉菌餅(直徑5mm)掐塊接于培養皿中心，從平板中心出發畫十字形，距菌餅中心25mm放置牛津杯。每個牛津杯中加入100μL無菌濾液及1%的氯霉素20μL，超凈工作臺中放置30min左右吹干，28℃培養72h后十字交叉法測量抑菌圈直徑，以未接種的培養基上清液作為空白對照，每次處理3個重復[13]。

1.3.3 目標菌株的鑒定

形態學鑒定：挑取少量目標菌株在LB平板上劃線，28℃培養20h后觀察單菌落形態并鏡檢。繼續培養至24h后進行芽孢染色并鏡檢。

生理生化鑒定：主要包括接觸酶實驗、甲基紅實驗、V-P實驗、淀粉水解、海藻酸鈉降解、檸檬酸鹽利用、Tween-80降解、明膠水解、酵母細胞溶解、卵磷脂降解、耐鹽性、酪氨酸水解、丙酸利用、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇等實驗。

16S rDNA鑒定：用于PCR擴增的引物為通用引物，正向引物16Sf：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；反向引物16Sr：5＇-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇。PCR反應體系(25μL)為：10×Buffer 2.5μL、10mmol/L dNTP 2.0μL、10μmol/L引物各2.5μL、Taq酶0.25μL、模板1.0μL、ddH2O 14.25μL，空白不加模板。PCR反應條件為：94℃變性5min；94℃變性30s、54℃引物復性1min、72℃延伸2min，35個循環；最后72℃延伸10min。所得PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳在標準條件下進行檢測后送至北京市擎科生物技術有限公司測序。所得序列利用BLAST程序在GenBank基因庫中進行比對，選取相似性較高菌株的16S rDNA序列，用MEGA 3.1軟件構建系統發育樹。

1.3.4 菌株L-NM62生理特性的研究

最適生長溫度確定：將目標菌株L-NM62，接種至含50mL LB培養基的300mL三角瓶中，輕輕振蕩，使菌體分布均勻，置于不同發酵溫度(20、24、28、32、37、42、45℃)，140r/min搖床培養24h，離心收集上清液，測600nm波長處的OD值。

最適pH值測定：將目標菌株L-NM62，分別接種至含不同pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)LB液體培養基中，在最適生長溫度140r/min搖床培養24h，取上清液測OD值。

最適接種量的確定：目標菌株采用不同接種量(0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%、3.00%、4.00%)，在最適生長溫度和pH值條件下，140r/min搖床培養24h，取上清液測600nm波長處的OD值。

最適條件下生長曲線的測定：將目標菌株L-NM62采用最適生長溫度、pH值及接種量至含50mL LB培養基的300mL三角瓶中，置于140r/min搖床中振蕩培養。每隔一段時間取樣，以未接種的液體培養基作對照，測定OD600nm值和發酵液pH值，然后以培養時間為橫坐標，OD600nm值及pH值為縱坐標，繪制曲線。

抗菌譜的測定：采用傾注平板法接入各種受試的細菌，然后將芽孢桿菌菌株點種在平板表面，37℃培養，觀察芽孢桿菌菌落周圍是否存在抑菌圈，并采用十字測量法測量芽孢桿菌菌落直徑及其產生的抑菌圈直徑。將熔化的PDA培養基倒入培養皿中，待培養基凝固后，從平板中心出發畫十字形，PDA平板的中央掐塊接入受試的各種霉菌菌餅(直徑5mm)，距菌餅中心25mm處點種芽孢桿菌株，每個實驗設3個重復，28℃培養3d，觀察拮抗作用是否存在并測量菌落大小。由于霉菌菌絲生長使抑菌圈形狀不規則，因此使用抑菌率衡量抑菌效果。以單獨接種各細菌、霉菌的平板作為對照。每處理3次重復。按下式計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離、篩選

采用稀釋傾注法從26種不同食品樣品中分離獲得204株芽孢桿菌，并分別進行斜面保藏和沙土管保藏。通過對峙培養法，從分離的204株芽孢桿菌，初篩出62株有清晰透明圈形成的芽孢桿菌。通過計算抑菌圈直徑與芽孢桿菌菌落直徑的比值來確定抑菌效果，結果獲得14株抑菌效果顯著的菌株見表1，部分初篩效果見圖1。

圖1 部分芽孢桿菌菌株產生的抑菌結果Fig.1 Inhibitory zone of part of anti-fungal Bacillus spp. to P. aphanidermatum

表1 初篩中有拮抗效果的菌株Table 1 Bacillus spp. with high antifungal activity to P. aphanidermatum by the first screening

將初篩得到的抑菌效果明顯的4株菌株(L-24、L-61、L-62、L-69)進行液體培養，離心取其上清液，采用牛津杯法測其發酵離心上清液的抗菌效果，發現4株芽孢桿菌發酵液都有抑菌圈產生，L-61、L-69的抑菌效果較差，抑菌圈直徑分別為(15.34±0.32)mm、(21.59±0.22)mm，L-24抑菌圈直徑為(22.04±0.29)mm，L-62抑菌效果明顯，抑菌圈直徑達到(24.54±0.13)mm，因此確定其為目標菌株，并命名為L-NM62。

2.2 目標菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態學鑒定結果

圖2 菌株L-NM62菌落形態圖(10×100)Fig.2 The morphological characteristic of L-NM62(10×100)

圖3 菌株L-NM62菌體形態圖Fig.3 The colony characteristic of L-NM62

菌株L-NM62在LB固體培養基中培養24h后發現其菌落形態不規則，近圓，菌落表面褶皺，邊緣波狀，不透明，濕黏(圖2)。顯微鏡下菌株L-NM62呈短桿狀，芽孢形狀為橢圓形，膨大，近端生(圖3)。

2.2.2 菌株L-NM62的生理生化鑒定

表2 菌株L-NM62的生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of L-NM62

從表2可以看出，該菌株接觸酶反應、甲基紅實驗、明膠水解、卵磷脂水解成陽性，能夠利用葡萄糖、淀粉，不能在10% NaCl溶液中生長但能夠在7% NaCl溶液中生長，初步將菌株L-NM62鑒定為枯草芽孢桿菌[14]。

2.2.3 16S rDNA 同源性的鑒定

進一步采用分子生物學手段對L-NM62菌株進行鑒定，其染色體DNA用PCR擴增出單一條帶，PCR產物回收純化后經DNA測序后與GenBank上序列進行比對發現，菌株L-NM62與枯草芽孢桿菌同源性最高，達95%。使用MEGA 3.1軟件建立系統發育樹(圖4)發現，菌株L-NM62與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)處于同一發育水平上。

圖4 菌株L-NM62的16S rDNAFig.4 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain L-NM62

根據表型、生理生化以及16S rDNA鑒定結果，可以判定菌株L-NM62為枯草芽孢桿菌，并將其命名為枯草芽孢桿菌L-NM62(Bacillus subtilisL-NM62)。

2.3 菌株L-NM62的生理特性研究

2.3.1 最適生長溫度的確定

由圖5可見，Bacillus subtilisL-NM62菌株在20～37℃之間，隨溫度的升高OD值逐漸增大，37℃達到最大，超過37℃，Bacillus subtilisL-NM62菌株OD值呈現下降趨勢，最終確定其最適生長溫度為37℃。

2.3.2 最適生長pH值的確定

在37℃測定不同pH值條件下Bacillus subtilisL-NM62生長的OD值，結果見圖6。pH值為7.5時OD值達到最大，故將pH值為7.5確定為該菌體的最適生長pH值。2.3.3 最適接種量的確定

圖7 最適接種量的確定Fig.7 Identification of optimal inoculums concentration

在菌株最適生長溫度37℃，起始pH7.5的條件下，測定Bacillus subtilisL-NM62在不同接種量下生長的OD值，結果見圖7。Bacillus subtilisL-NM62菌株在0.05%～0.50%之間，隨著接種量的增大OD值增大，在接種量1.00%處達到最大，故將1.00%作為最適接種量，超過最適接種量，菌株OD值隨著接種量的增大而減小。

2.3.4 最適生長條件下目標菌株的生長曲線

圖8 最適條件下枯草芽孢桿菌L-NM62的生長曲線Fig.8 Growth curve of L-NM62 under the optimal conditions

由圖8可知，Bacillus subtilisL-NM62在0～8h生長緩慢，隨后迅速生長進入對數生長期，20h后生長趨于平穩到達穩定期。同時也可以看出，該菌株穩定期較長。Bacillus subtilisL-NM62在培養過程中，pH值基本穩定，由于胺類物質的分解造成，pH值略有上升趨勢。

2.3.5 抗菌譜的測定

采用對峙培養法進一步考察Bacillus subtilisL-NM62對15株常見有害細菌與真菌的抗菌效果，結果如表3所示。

從表3可以明顯看出，Bacillus subtilisL-NM62表現出了廣譜的抗菌活性，不僅對金黃色葡萄球菌、假單胞菌等細菌具有一定的抑制作用，而且對真菌尤其是病原霉菌表現出了高效的抗菌效果，顯示出了很好的開發應用潛力。

表3 Bacillus subtilis L-NM62的抗菌譜實驗結果Table 3 The antibacterial and anti-fungal spectrum of Bacillus subtilis L-NM62

3 討 論

芽孢桿菌是一群好氧或兼性厭氧、產芽孢的G＋桿菌的總稱[15]。其典型特點是能產生耐熱抗逆的芽孢，因而有利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環境中存活與繁殖。國外關于芽孢桿菌對植物病害的防治已做了大量工作，很多菌株已成功用于農業生產。如芽孢桿菌QST713、GBO3、MBI600、FZB24等菌株作為生防菌已得到了美國國家壞境保護局(Environmental Protenction Agenay，EPA)商品化或有限商品化生產應用的許可。其中應用最廣泛的是枯草芽孢桿菌[16-19]、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及臘狀芽孢桿菌等。

已有研究[12]表明，枯芽孢桿菌所產抗菌物質大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽性菌，有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母菌。芽孢桿菌產生抗菌物質的途徑分為核糖體和非核糖體合成兩種。核糖體途徑產生的抗菌物質包括細菌素與類細菌素、酶類和活性蛋白3類；非核糖體途徑產生的抗菌物質包括脂肽和多肽兩大類，其中脂肽又包括Surfactin、Iturin和Fengycin 3類[13,20]。本研究分離獲得的枯草芽孢桿菌產生的抗菌物質究竟是屬于哪類物質還需進一步研究。本實驗室將在現有研究基礎上，進一步開展Bacillus subtilisL-NM62所產抗菌物質的分離純化，確定其抗菌類型，研究其理化與應用特性，分析其空間結構，探討其抗菌機理，為該菌株及其所產抗菌物質的應用提供理論依據及前期工作積累。

本實驗選擇多種食品作為原料來篩選抗瓜果腐霉的優良芽孢桿菌，主要是考慮到存在于高滲及干燥食品中篩選出芽孢桿菌的概率較大，且芽孢桿菌可能脅迫不良環境的能力更強。從本實驗結果可以看出，經初篩后的芽孢桿菌有62株對瓜果腐霉顯現出了明顯的拮抗作用，而經復篩后確定的目標菌株L-NM62，其菌體細胞及發酵上清液均對瓜果腐霉表現出了強烈的抑制效果。同時通過對目標菌株生物學特性研究還發現，該菌有較為廣譜的抗菌活性，不僅對常見的食品腐敗細菌有抑制作用，尤其是對真菌中的黑根霉、總狀毛霉、白地霉、赤散囊菌、灰霉等均有顯著的抑菌效果，顯示出了很好的潛在價值和應用前景。本實驗所篩選出來的目標菌株L-NM62其發酵上清液對瓜果腐霉具有高效的抑制作用，同時具有較廣抗菌范圍，尤其表現出對一些真菌有較為強烈的抑制作用，因而，在今后使用目標菌株L-NM62進行生物防治的過程中可以同時對多種致病菌產生抑菌效果，增加其應用空間及開發價值。

4 結 論

本實驗從26個食品樣品中分離獲得204株芽孢桿菌，通過對峙培養法初篩、牛津杯擴散法復篩，最終篩選出一株芽孢桿菌L-NM62，其發酵上清液對瓜果腐霉的抑菌圈直徑達到(24.54±0.13)mm，通過形態學、生理生化指標測定及16S rDNA 序列分析，最終將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌L-NM62(Bacillus subtilisL-NM62)。通過對其生物學特性研究發現，Bacillus subtilisL-NM62最適生長溫度為37℃，最適生長pH值為7.5，最適接種量為1%，且該菌表現出了廣譜的抗菌活性，不僅對金黃色葡萄球菌、假單胞菌等細菌具有一定的抑制作用，而且對真菌尤其是病原霉菌表現出了高效的抗菌效果，具有很好的開發與應用潛力。

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Screening and Biological Characteristics ofBacillussp. with High Anti-fungal activity againstPythium aphanidermatum

ZHANG Xu1，SHANG Nan1，ZHANG Bao1，ZHANG Zhi-gang2，SHANG Qing-mao2,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China) 2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081, China)

Pythium aphanidermatumis known as an important plant pathogenic fungus that can cause various types of crops rot and damping off, as well as results in spoilage of fruits and vegetables, thus leading to great loss of agricultural production and food industry. In order to obtain spore-forming bacteria with anti-fungal activity for fruit and vegetable preservation and biological control, we have screened 204 strains of spore-forming bacteria isolated from 26 kinds of foods, such as lemon, grape, Chinese date, yogurt, fermented bean curd, Harbin sausage, bean paste and other food samples. Totally 62 strains of sporeforming bacteria were assessed by confrontation culture tests to reveal strong anti-fungal activity againstP.aphanidermatum. The fermentation supernatants of 4 strains with stronger anti-fungal activity through Oxford cup plate assay method were tested for their anti-fungal activity, and L-NM62 revealed the strongest anti-fungal activity againstP.aphanidermatum. The inhibition zone of cell free supernatant was (24.54 ± 0.13) mm in diameter. According to the characteristics of morphology, physiology and biochemistry tests, and the comparison of 16S rDNA sequence, strain L-NM62 was identified asBacillus subtilis. Further study of L-NM62 on physiology characteristics showed that the optimal growth temperature, pH and inoculums were 37 ℃, 7.5 and 1.0%. Under these optimal conditions, L-NM62 had a wide anti-fungal and antibacterial activity and presented a potential prospect.

Bacillus subtilis；Pythium aphanidermatum；screening；anti-fungal activity；biological characteristics

Q936

A

1002-6630(2012)05-0138-06

2011-06-30

國家自然科學基金項目(31172001)；北京市大學生科學研究與創業行動計劃項目

張旭(1990—)，女，本科生，主要從事益生菌研究。E-mail：hangxu19901218@163.com

*通信作者：尚慶茂(1965—)，男，研究員，博士，主要從事蔬菜工廠化育苗技術研究。E-mail：shangqm08@yahoo.com.cn