填飼對鵝肥肝脂肪酸合成酶基因mRNA表達的影響

劉振春，郭 炫，楊童奧，梁國朋，吳 偉*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

填飼對鵝肥肝脂肪酸合成酶基因mRNA表達的影響

劉振春，郭 炫，楊童奧，梁國朋，吳 偉*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

以朗德鵝為對象，采用實時熒光定量PCR法研究不同填飼周齡脂肪酸合成酶基因(FAS基因)表達的規律性。結果顯示，FAS基因相對表達量(FAS與β-actin基因表達量的比值)在填飼前、填飼1周、填飼2周、填飼3周和填飼4周相對表達量逐漸增高，分別為0.035、0.128、0.253、0.876、1.009，說明肥肝組織中FAS基因表達豐度與填飼期呈顯著正相關，FAS基因在鵝肥肝形成過程及體脂沉積過程中具有一定的調控作用，為促進鵝肝內脂肪沉積的主要調控基因。

填飼；鵝肥肝；脂肪酸合成酶；基因表達

鵝肥肝主要是指朗德鵝生長發育基本完成后，在短期內(2～3周)人工對生長發育至一定體質量(一般為4.5kg左右)的鵝進行強制填喂過量玉米或糙米等高能量的碳水化合物飼料，使這些飼料通過鵝機體正常的新陳代謝，轉化為甘油三酯(TG)并在肝臟內貯存而獲得比正常鵝肝重5～10倍的脂肪肝[1]，它是一種高檔的新型家禽產品。鵝肥肝并不影響鵝的正常身體代謝，法國Grassey教授精辟地指出：“禽類吃了含多種糖分和大量淀粉的飼料后，生成沉積于皮下、腹腔和肝臟中的脂肪，這種脂肪的出現是一種正常狀態，就像豬在皮下沉積脂肪是一個機理”。大量的脂肪沉積在鵝肥肝中，在質量和生理理化性狀兩方面都和超期飼養前鵝的普通肝有很大差異，因此鵝肥肝和鵝肝的概念是完全不同的。鵝肥肝含有蛋白質、脂肪、維生素、卵磷脂、甘油三酯、各種酶、核糖核酸、脫氧核糖核酸和多種微量元素等營養成分[2]。經填飼后的肥鵝肝，其營養成分發生了顯著變化，脂肪含量高達60%～70%左右，是正常肝的7～12倍；不飽和脂肪酸比動物油中含脂肪較高的豬油還要高11%以上，比正常肝相對含量增加20倍；卵磷脂增加4倍；酶活性增加3倍；核糖核酸和脫氧核糖核酸增加1倍[3-4]。每100g肥肝中卵磷脂含量高達4.5～7g，脫氧核糖酸和核糖核酸含量達9～13.5g。

“卵磷脂”是當今國際市場保健藥物和食品中必不可少的重要成分，具有降低血脂，軟化血管，延緩衰老，防治心腦血管疾病發生的功效；而亞油酸為人體所必需，且在人體內不能合成，必須由食物中攝取，可降低人體血液中膽固醇的含量[5-6]。鵝肥肝與普通鵝肝相比，有效營養物質在體內氧化后產生的熱量增加10倍[7]，極大地提高了它的營養價值和食療價值[8]。本研究利用實時熒光定量法測定鵝肥肝中脂肪酸合成酶基因(FAS基因) mRNA表達豐度變化規律，以驗證FAS基因是鵝肥肝形成過程中關鍵調控基因，旨在為今后鵝肥肝填飼提供有價值的技術參數。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集

選取由吉林省9臺順達鵝業有限公司的同批孵化和在相同飼養管理條件下統一飼養的健康朗德鵝132只，體質量4.5kg，10周齡，并進行隨機編號，填飼28d。每個填飼階段結束后，隨機抽取20只宰殺，迅速取肝臟10g左右，放入10mL凍存管中快速置入液氮中保存，帶回實驗室后盡快提取RNA，以免其降解。

1.2 試劑與儀器

焦碳酸二乙酯(DEPC) 美國Sigma公司；Trizol試劑 美國Invitrogen公司；氯仿 天津化學試劑有限公司；異丙醇 北京化工廠；反轉錄試劑盒 日本TaKaRa公司；DNA Marker DL2000 天為時代生物有限公司；DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；小劑量快速質粒DNA提取試劑盒 美國Omega公司。

超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；核酸濃度測定儀 英國Pharmacia Biotech公司；ABI System 7000型熒光定量PCR儀 美國ABI公司；－80℃超低溫冰箱 日本Sanyo公司；低溫高速離心機 美國Sigma公司。

1.3 總RNA提取

采用Trizol一步法，用于總RNA提取的塑料器皿、耗材均經過0.1% DEPC處理，玻璃器皿于180℃干烤8h以上。具體操作步驟參照說明書。

將2μL RNA溶液加入198μL的0.1% DEPC處理的水中，以DEPC處理水為空白對照，用紫外分光光度計測定其在波長260nm處的光密度值(OD260nm)以及波長260nm與波長280nm處OD值的比值(OD260nm/OD280nm)及總RNA濃度。

1.4 反轉錄合成cDNA

采用AMV反轉錄酶，以提取的鵝肥肝總RNA為模板，以Oligo-dT為引物(工作濃度為10pmol/μL)進行反轉錄反應。

1.5 PCR擴增

根據GenBank中原雞的FAS(NM_205155.1)和β-actin(L08165.1)的mRNA序列設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，詳見表1。

表1 RT-PCR反應所用引物Table 1 Primers of RT-PCR

運用常規PCR法，用內參引物以反轉錄產物為模板進行擴增，驗證cDNA的完整性。然后擴增目的片段，得到的PCR產物可以用于制備熒光定量PCR的陽性對照標準品。

1.6 PCR回收

采用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物目的片段，目的片段DNA溶液于－20℃保存。

1.7 目的片段克隆與測序

將凝膠回收的目的DNA片段連接到pMD-18T載體上，用CaCl2法制備E.coliDH5α感受態宿主菌(在嚴格的無菌條件下制備感受態)，分別擴增128bp和316bp的目的片段和81bp的內參片段，將PCR鑒定正確的重組質粒送上海Sangon公司進行序列測定。

1.8 實時熒光定量PCR

將質粒溶液用純水進行梯度稀釋，分別稀釋到1×109、1×108、1×107、1×106、1×105copies/μL，即為實驗設計標準品的5個水平，每個水平設3個重復，3個陰性對照。加樣過程中，要確保相同處理各管反應液的均一性，且確保各管加樣量一致。另外還需注意防止96孔反應板上各管的交叉污染。

設置熒光定量PCR儀程序。與探針法不同的是，染料法需要附加一個溶解曲線制作反應。

2 結果與分析

2.1 鵝肥肝中總RNA的提取

所提取的RNA樣品用分光光度計測定，所有的RNA樣品OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.1之間，總RNA電泳圖有清晰的28S、18S條帶(圖1)，表明所提取總RNA完整性較好，無降解，RNA質量符合RT-PCR實驗要求。

圖1 鵝肥肝總RNA電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of total RNA from tissues

2.2 實時熒光定量PCR檢測的靈敏性

以梯度稀釋的標準品為陽性模板進行實時熒光定量PCR反應得到的擴增曲線見圖2、3。

圖2 FAS基因擴增的循環數與熒光強度的關系Fig.2 Correlation between cycle number of FAS gene amplification and fluorescence intensity

圖3 β-actin基因擴增的循環數與熒光強度的關系Fig.3 Correlation between cycle number of β-actin gene amplification and fluorescence intensity

由圖2、3可知，不同拷貝數的檢測范圍較廣，循環閾值(Ct)范圍在13～35，擴增前期曲線重合性好且無雜峰，呈典型S型熒光定量學曲線，是理想的擴增曲線，說明實時熒光定量PCR檢測FAS基因具有較好的敏感性，反映出樣品擴增效率較好。

2.3 實時熒光定量PCR擴增產物的溶解曲線和假陽性曲線

以不同拷貝數陽性標準品模板的對數為橫坐標，以熒光定量PCR反應過程中出現熒光信號的初始Ct為縱坐標繪制FAS基因和β-actin基因的標準曲線，其中熒光信號的初始Ct是指圖中不同拷貝數的模板與虛線相交處的循環數。FAS基因的標準曲線方程為：Y＝－3.588x＋14.447(R2＝0.994)，擴增效率為90.0%；β-actin基因的標準曲線方程為：Y＝－3.684x＋14.067(R2＝0.994)，擴增效率為86.8%；說明實驗擴增效果好，具有較高的可靠性。

陽性模板在實時熒光定量PCR反應的后期，產物經熔融、冷卻得到溶解曲線。其中橫坐標代表熒光值(－d(RFU)/dT)，縱坐標代表溫度，見圖4、5。

圖4 FAS基因擴增溶解曲線Fig.4 Dissociation curve of FAS gene amplified product

圖5 β-actin基因擴增產物溶解曲線Fig.5 Dissociation curve of β-actin gene amplification product

由圖4、5可知，溶解曲線成單峰，說明擴增產物單一，避免了假陽性結果的出現，擴增產物特異性好。

2.4 填飼不同周齡FAS基因表達規律

采用相對定量，即FAS和β-actin熒光定量的比值(FAS/β-actin比值)來表示。FAS和β-actin熒光定量的比值測定結果見表2。填飼前、填飼不同周齡，鵝肥肝組織中FASmRNA表達量差異顯著(P＜0.05)。填飼前與填飼1周差異不顯著(P＞0.05)，填飼3周、填飼4周與填飼1周FAS基因的mRNA相對表達量差異顯著(P＜0.05)。

由表3方差分析結果可以看出，不同填飼周齡鵝肥肝中FAS基因相對表達量逐漸增加。填飼前FAS基因相對表達量很低，僅為0.035±0.032，此時對應的肝質量為(105±31)g；填飼1周FAS基因相對表達量為0.128± 0.031，肝質量為(242±40)g，FAS基因相對表達量增加了0.093，肝質量增加了137g；填飼2周FAS基因相對表達量為0.253±0.049，肝質量(467±163)g，FAS基因相對表達量增加了0.125，肝質量增加了225g；填飼3周FAS基因相對表達量為0.876±0.162，肝質量(805± 181)g，FAS基因相對表達量增加了0.623，肝質量增加了338g；填飼4周FAS基因相對表達量為1.009±0.435，肝質量(995±220)g，FAS基因相對表達量增加了0.133，肝質量增加了190g。表明FAS基因相對表達量在填飼第3周時增加迅速，肝質量增加量也大，而填飼第4周，FAS基因相對表達量增加少，肝質量增加也隨之減少。

根據表3結果，對FAS基因相對表達量(y)與填飼周齡(x)進行似合，得線性回歸方程為：y＝0.2696x－0.2138(R2＝0.8994)，說明FAS基因相對表達量與填飼不同周齡呈正相關，填飼周齡越長，FAS基因相對表達量越高，但后期(填飼4周)增加不顯著。量不斷增加，增加趨勢與肝質量增加速度基本一致，特別在填飼第3周時FAS基因相對表達量增加達到最高值，此時肝質量增加也達最高值338g，鵝肥肝質量也超過750g，隨后FAS基因相對表達量趨于平穩，肝質量增加緩慢，說明填飼前期(1～3周)脂肪主要沉積在肝內，填飼超過21d脂肪就會向肝外組織轉移。同時隨著填飼量和填飼次數的增加，FAS基因在填飼不同周齡的相對表達量也逐漸升高，脂肪在肝內外的沉積量也隨之增加，從而表明填飼對基因FAS的表達影響及其對鵝肥肝增重的作用是非常顯著的。但Nogalska等[9]研究表明，不同日齡豬腹脂FAS基因表達量隨日齡增大呈逐漸增加的趨勢。

表3 不同填飼期FAS基因的相對表達量測定結果Table 3 Expression of FAS/β-actin in different feeding periods

3.2FAS基因對鵝肥肝脂肪形成的調控作用

熒光定量PCR結果顯示FAS基因相對表達量在填飼前，填飼1～4周逐漸增高，分別為0.035、0.128、0.253、0.876、1.009。FAS基因相對表達量與填飼期顯著正相關(R2＝0.8994，P＝0.037＜0.05)。Badger 等[10]研究發現，雞肝FAS豐度越高越能顯著提高體內TG的沉積，其活性與肝臟中脂肪的合成與體脂沉積呈正相關。劉濤[11]研究表明，綿羊尾部脂肪組織中的FAS基因表達豐度與體質量呈顯著正相關。Reiter等[12-13]研究發現，豬肝臟組織中FASmRNA表達豐度與體脂肪含量呈正相關，這與本研究結果相一致，表明FAS基因是鵝肝脂肪沉積的主要調控基因，其表達量的高低直接影響脂肪在肝內外的沉積量。

3 討論與結論

3.1 鵝肥肝組織中FASmRNA表達量與產肝性能的相關性分析

本研究得出，FAS基因相對表達量與鵝肥肝質量呈正相關。填飼前FAS基因表達量很低，鵝肝質量只有(105±31)g，隨飼喂周齡不斷延長，FAS基因相對表達

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Effect of Feeding Period on Expression ofFASmRNA in Fatty Liver of Goose

LIU Zhen-chun，GUO Xuan，YANG Tong-ao，LIANG Guo-peng，WU Wei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Landes geese were used as the materials to explore the expression rule ofFASmRNA in fatty liver through real-time fluorescence quantitative PCR method during overfeeding weeks. Fluorescence quantitative PCR results showed that the expression ofFASgene revealed an obvious increase during pre-feeding fold and pro-feeding 1 week, feeding 2 weeks, feeding 3 weeks and feeding 4 weeks, which were 0.035, 0.128, 0.253, 0.876 fold and 1.009 fold enhancement, respectively. A positive genetic correlation betweenFASmRNA expression in fatty liver tissue and feeding weeks was observed. These results suggested thatFASgene had a certain readjustment function during the developing process of fatty liver in goose and the process of body fat deposition. Thus,FASis a regulation gene to promote fat deposit inside liver of goose, which provides valuable technical parameters for future studies of fatty liver.

feeding；fatty liver of goose；fatty acid synthase；gene expression

TS251.1

A

1002-6630(2012)05-0165-05

2011-04-07

吉林省科技廳科技發展計劃重點項目(2009026)

劉振春(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品營養與功能性食品。E-mail：liuzhenchun63@163.com

*通信作者：吳偉(1955—)，男，教授，博士，研究方向為動物營養與種性。E-mail：jilinww@yahoo.com.cn