濃香型白酒窖泥中高產己酸兼性厭氧細菌的分離鑒定

趙 輝，敞 顏，王 葳，凌宏志，平文祥，趙志昌，楊朝輝

(1.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；3.黑龍江省富裕老窖酒業有限公司，黑龍江 富裕 161200)

濃香型白酒窖泥中高產己酸兼性厭氧細菌的分離鑒定

趙 輝1,2，敞 顏1,2，王 葳1,2，凌宏志1,2，平文祥1,2，趙志昌3，楊朝輝3

(1.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；3.黑龍江省富裕老窖酒業有限公司，黑龍江 富裕 161200)

篩選及鑒定白酒窖泥中高產己酸的細菌，以應用于窖池保養及人工窖泥培養。從東北地區某酒廠優質窖泥中采用兼性厭氧培養及微量成分分析的方法，分離篩選出3株(C78、a57、A17)高產己酸的兼性厭氧細菌，其產己酸量分別為：213.6914、170.465、103.5097mg/100mL，經形態學、生理生化特征和分子生物學鑒定其分別為：巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、梭狀芽孢桿菌(Bacillus fusiformis)及地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，相應最適pH值分別為7、6.5、7，最適溫度分別為34、34、37℃，最適接種量分別為5%、5%、3%。

濃香型白酒；窖泥；產己酸細菌；鑒定

白酒是我國傳統的發酵食品，因其獨特的釀造工藝及其呈現的特殊風味，在世界酒類產品中別具一格。白酒種類繁多，分類各異。根據主體香成分的不同，可分為濃香型、醬香型、清香型、兼香型、鳳香型、藥香型和米香型等十幾種香型。目前，濃香型白酒是白酒行業的主流，其產銷量占白酒總產銷量的70%[1]。在傳統固態濃香型白酒發酵中，窖泥是白酒風味的基礎，長期的工藝操作使窖泥富集了種類繁多、功能各異的益于釀酒的微生物菌群[2-9]。己酸菌是其中最重要的窖泥功能菌，其數量的多少以及其功能的強弱直接影響著濃香型大曲酒中特征風味物質的形成。己酸菌所產生的己酸在白酒中不僅起到呈香、助香、減少酒體刺激以及緩沖平衡的作用，而且還可以與乙醇發生酯化反應，生成濃香型大曲酒的主體香成分己酸乙酯，從而改善濃香型白酒的風味及口感。己酸產生細菌可應用于窖池保養以及人工窖泥培養等，可有效改善窖泥微生態環境，進而提高濃香型白酒的質量，對名優白酒生產的異地再現有著積極的意義[10-12]。

對產己酸菌的分離、篩選、分類、鑒定以及選育，是提高窖泥中己酸菌數量和質量的保證[13-16]。產己酸的細菌包括兼性厭氧和厭氧菌兩大類，篩選兼性厭氧細菌可以降低己酸菌在窖泥使用過程中的應用成本，具有更高的應用價值。本實驗采用非厭氧培養條件從優質窖泥中分離、純化、篩選出高產己酸的兼性厭氧功能細菌，并進行生理生化及分子生物學鑒定，以期為使用人工窖泥擴大窖池內的優勢菌群、改善窖內微生態環境、提高濃香型白酒質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

窖泥：取自某酒廠優質濃香型大曲酒發酵池。

分離和保藏培養基：5g乙酸鈉、0.5g硫酸銨、0.4g磷酸氫二鉀、0.2g硫酸鎂、1g酵母膏、20mL乙醇(培養基滅菌后接種前加入)、5g碳酸鈣、10mL 0.1%溴百里酚藍指示劑、15～20g瓊脂，加水至1000mL，調pH值為7.0，121℃滅菌20min。

發酵培養基：5g蛋白胨、5g牛肉膏、25g葡萄糖、5g NaCl，1000mL蒸餾水，pH7.0，121℃滅菌20min。

細菌基因組、質粒提取及DNA純化回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司；正反向引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；pMD19-T載體、DNA聚合酶、DNA Marker、PCR產物克隆試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司；乙酸丁酯、乙酸、丁酸、己酸、丁酸乙酯、己酸乙酯為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CF16RXII 高速冷凍離心機 日本日立公司；UV755B紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Tprofessional Thermocycler PCR儀 德國Biometra公司；DNP-9082電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱東聯電子技術有限公司；GC7890氣相色譜儀 上海天美科學儀器有限公司；凝膠成像系統儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 高產己酸細菌的篩選

稱取窖泥1g，放入盛有99mL無菌水且含有無菌玻璃珠的三角燒瓶中，用力振蕩，使窖泥分散均勻，80℃水浴加熱10min，淘汰非芽孢細菌，富集含芽孢優勢細菌[17]。

吸取富集菌液1mL，將10-1～10-6梯度的稀釋菌懸液分別涂布于篩選培養基(含有溴百里酚藍指示劑)上，每個梯度做3個平行樣，倒置于37℃恒溫培養24h，篩選出黃色菌落，根據其菌落形態及顯微形態的不同將其簡單歸類，并進行純化保藏。

1.3.2 高產己酸細菌的復篩

分離純化出的菌株活化后，分別接入發酵培養基中進行單菌種發酵。發酵結束后測定總酸、總酯含量，并對發酵液進行己酸的定性分析，對含己酸的發酵液再利用氣相色譜法測定其己酸及重要香味成分的產量，復篩出高產己酸的功能細菌[18-20]。

1.3.3 菌株形態學觀察及生理生化鑒定

篩選出的高產己酸細菌的形態學觀察和生理生化鑒定方法參照《伯杰細菌鑒定手冊》[21]和《常見細菌系統鑒定手冊》[22]。生理生化鑒定包括氧對菌株的影響、接觸酶實驗、淀粉水解實驗、葡萄糖氧化發酵產酸產氣實驗、甲基紅實驗(M.R.實驗)、吲哚實驗、明膠液化、石蕊牛奶實驗、脲酶實驗等生理生化實驗，每個實驗均重復3次且設有陰性和陽性對照[23-24]。

1.3.4 篩選菌株的16S rDNA鑒定

1.3.4.1 提取細菌基因組DNA

使用細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取基因組DNA。

1.3.4.2 PCR擴增16S rDNA序列片段及克隆

以己酸產生細菌的基因組DNA為模板，用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增。引物序列如下：正向引物8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1512R：5′-ACGGCTACCT TGTTACGACTT-3′。PCR擴增反應體系為：10×PCR緩沖液 2.5μL，dNTP 2μL，正向引物與反向引物各1μL，DNA模板1μL，滅菌水17.3μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，總計25μL。

PCR擴增反應程序：94℃預變性10min；94℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，32個循環；72℃終延伸7min，4℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，并使用DNA純化回收試劑盒對PCR擴增產物進行純化及回收。使用TaKaRa連接試劑盒，將純化后的目的片段連接至pMD19-T 載體上，目的片段與載體連接反應體系如表1所示。混合均勻后，4℃靜置過夜。連接結束后，轉化E.coliDH5α感受態細胞，并進行藍白篩選。

對重組陽性質粒保存并進行擴大培養，提取質粒，進行PCR檢測，以驗證克隆結果。

表1 PCR擴增產物純化后的目的片段與載體連接反應體系Table 1 Coupled reaction system(10μL)

1.3.4.3 16S rDNA片段的測序與系統發育分析

序列測定由上海博亞生物技術有限公司進行。將測序所得到的16S rDNA全序列提交到GeneBank數據庫，并應用Blast軟件進行同源性搜索、比對分析，再應用DNAMAN軟件構建系統發育樹[25-26]。

1.3.5 篩選菌株培養條件的研究

設置發酵培養基的pH值梯度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；培養溫度的梯度為28、31、35、37、40℃；接種量的梯度為2%、3%、4%、5%、6%，將種子液接種于培養基中，置于恒溫培養箱中培養，進行單因素試驗。培養后梯度稀釋涂平板，計算菌液濃度，重復3次，分別確定培養的最適pH值、溫度和接種量。

1.3.6 指標檢測方法

1.3.6.1 發酵液總酸、總酯產量的測定

總酸產量測定采用電位滴定法，總酯產量測定采用皂化法[25]。

1.3.6.2 己酸的定性分析

用移液管吸取1.5mL發酵液，緩慢沿壁滴加到含有5mL 20% CuSO4溶液的試管中，靜置10min后觀察CuSO4溶液中是否有藍色絮狀沉淀產生。若有，則說明發酵液中有己酸生成，否則說明沒有[26]。

1.3.6.3 己酸等主要代謝產物測定

采用氣相色譜法，用直徑為0.22μm的過濾器對發酵液進行過濾，得到澄清透明溶液。以乙酸丁酯為內標，待測樣品進樣量為0.3μL。氣相色譜法分析條件：用PEG2.0×107(聚乙二醇)毛細管色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)，氫火焰離子檢測器，柱溫采取程序升溫：初始溫度為65℃，保持2min，然后以5℃/min的速率升溫，升至 200℃時保持10min。進樣器溫度為260℃，檢測器溫度為260℃，載氣(高純氮氣)流速：0.5～1.0mL/min，分流比20:1～100:1。

2 結果與分析

2.1 高產己酸細菌的分離篩選

通過篩選培養基篩選出黃色或黃綠色菌落為產酸菌。對其進行菌落形態描述和顯微形態觀察，共篩選出了18株不同的細菌，將產酸菌菌落進行純化、保存，并對其進行產總酸、總酯產量分析、CuSO4顯色法己酸定性分析和氣相色譜分析。其中篩選得到的3株細菌，產總酸、總酯產量較高，結果如表2所示，CuSO4顯色己酸定性分析表明皆含有己酸，在此基礎上進一步進行氣相色譜對酸、酯微量成分分析，結果見表3。

表2 發酵液中總酸、總酯產量Table 2 The contents of total acids and total esters in fermentation liquid

表3 發酵液中酸、酯微量成分氣相色譜分析Table 3 Gas chromatographic analysis of fermentation liquid compositions

由表3可知，C78產己酸量最高，達到213.6914mg/ 100mL，a57次之，產量為170.465mg/100mL，A17己酸產量雖為103.5097mg/100mL，但A17發酵液中的乙酸、丁酸以及丁酸乙酯等酒體呈香、呈味物質的含量在18株菌株發酵液中均較高。綜合考慮，以己酸產量為主、其他呈香、呈味物質為輔復篩出了3株高產己酸的優良功能菌株a57、A17、C78。

表4 細菌菌落形態及顯微形態Table 4 Colonial and microscopic characteristics of the isolated strains

2.2 篩選菌株的鑒定

2.2.1 篩選菌株的形態學觀察及生理生化鑒定

篩選出的3株高產己酸細菌a57、A17、C78菌落形態觀察、顯微形態觀察如表4所示。生理生化實驗結果如表5所示。初步確定菌株a57、A17、C78均為芽孢桿菌屬(Bacillus cohn)。

表5 菌株生理生化特性Table 5 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strains

圖1 16S rDNA PCR擴增產物電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis for 16S rDNA PCR amplified products

利用細菌DNA提取試劑盒對菌株a57、A17、C78的培養液進行基因組DNA的提取。將提取基因組DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠成像系統可以看到單一、清晰且整齊的條帶，表明所提取基因組DNA樣品無降解、較完整。獲得功能菌株a57、A17、C78基因組DNA后，用細菌通用引物對其進行16S rDNA PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳，得到特異單一條帶，結果如圖1所示， a57、 A17、 C78與預計條帶大小1600bp吻合。

將PCR擴增16S rDNA目的片段與pMD19-T Vector連接后，轉化感受態細胞E.coliDH5α，進行藍白篩選。用質粒提取試劑盒提取質粒并進行PCR擴增，其電泳結果如圖2所示，目的片段轉化成功，得到了陽性克隆。

將陽性克隆進行測序，菌株a57、A17、C78 16S rDNA測序結果在GeneBank數據庫中利用Blast進行比對分

注：＋.陽性反應；－.陰性反應；－(+).不產氣或弱產氣。

2.2.2 菌株的16S rDNA鑒定及系統發育分析析，分析顯示菌株a57與Bacillus fusiformisstrain Z1相似性最高，達99%，序列號為AY548950；菌株A17與Bacillus licheniformisstrain B8相似性最高，達99%，序列號為EU117278；菌株C18與Bacillus megateriumstrain SB3112相似性最高，達99%，序列號為GU191918。利用DNAMAN軟件繪制菌株a57、A17、C78的系統發育樹，結果如圖3所示。結合菌落形態和生理生化分析，可以確定菌株a57為梭狀芽孢桿菌(Bacillus fusiformis)，A17為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，C78為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。

圖2 重組質粒PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of recombinant plasmids

圖3 基于菌株a57(a)、A17(b)、C78(c) 16S rDNA基因的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain a57(a), A17(b) and C78(c) based on 16S rDNA gene sequence

2.3 篩選菌株培養條件的結果

圖4 pH值(a)、溫度(b)、接種量(c)對菌體濃度的影響Fig.4 Effect of pH (a), temperature (b) and inoculum size (c) on the concentration of bacteria

由圖4a可知，A17和C78的最適pH值為7，a57的最適pH值為6.5；由圖4b可知，a57和C78的最適溫度為34℃，A17的最適溫度為37℃；由圖4c可知，A17最適接種量為3%，a57和C78的最適接種量為5%；此時相應培養的菌體濃度均達到最大。實際應用時，可在最適條件下進行單獨或混合培養，在菌體濃度較高時，制成液體窖泥噴灑于濃香型酒窖的窖底和四壁，增加窖泥中己酸細菌的濃度，以促進白酒發酵生香；亦可單獨或混合接種于酒窖外人工培養的固體窖泥，增加窖泥中產香功能菌的濃度。

3 結論與討論

從某濃香型大曲酒廠優質窖泥中進行兼性厭氧己酸細菌的分離篩選，得到3株高產己酸的功能細菌A17、 a57及C78，經氣相色譜法對其發酵液中己酸產量進行檢測，產量分別為103.5097、170.465、213.6914mg/100mL。通過菌落形態、細胞顯微形態觀察、生理生化實驗及分子生物學手段對菌株a57、A17及C78進行鑒定，其結果分別為：梭狀芽孢桿菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，并對其培養條件進行了初步研究，為高效人工窖泥的應用提供參考。

提高濃香型白酒的質量，需要適當地提高白酒中己酸乙酯的產量，也就要保證窖泥中己酸菌等功能菌的數量。在白酒生產中，窖泥使用一段時間后會老化，己酸菌等功能菌數量大量減少，嚴重影響著白酒的質量及優級品率。為防止窖泥老化、縮短新窖老熟時間，就需要進行窖泥養護和人工窖泥培養等方面的研究[27-28]。本實驗采取非厭氧培養的方法分離得到了3株高產己酸的兼性厭氧細菌，與厭氧己酸細菌Clostridium kluyverii相比[29]，更易于實現窖外窖泥的養護和人工窖泥的培養，可提高窖泥培養效果，節約培養成本，并且Bacillus fusiformis、Bacillus licheniformis和Bacillus megaterium已廣泛作為酶及食品添加劑工業的發酵菌種，具有較高的生物安全性。

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Isolation and Identification of Facultative Anaerobic Strains with High Yield of Hexanoic Acid from Luzhou-flavor Liquor Pit Mud

ZHAO Hui1,2，CHANG Yan1,2，WANG Wei1,2，LING Hong-zhi1,2，PING Wen-xiang1,2，ZHAO Zhi-chang3，YANG Zhao-hui3
(1. College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China；2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Harbin 150500, China；3. Heilongjiang Fuyulaojiao Brewery Co. Ltd., Fuyu 161200, China)

In order to screen and identify hexanoic acid-producing anaerobic bacteria with high yield from liquor pit mud and to apply it in maintaining pits or artificial pit mud. The hexanoic acid-producing anaerobic strains with high yield were isolated and selected from the fine pit mud of the distillery in the northeast area by facultative anaerobic culture and trace component analysis. The yields of hexanoic acid were up to 213.6914, 170.465 mg/100 mL and 103.5097 mg/100 mL, respectively. The species identification showed that three strains wereBacillus fusiformis,Bacillus licheniformis andBacillus megaterium, respectively, through morphological observation, physiological and biochemical tests and molecular biology methods. The optimal pH was 7, 6.5 and 7 and the optimal temperatures were 34, 34 ℃ and 37 ℃ as well as the optimal inoculums were 5%, 5% and 3%. This study provides a theatrical guidance for the application of efficiently artificial pit mud.

Luzhou-flavor liquor；pit mud；hexanoic acid-producing bacteria；identification

Q815

A

1002-6630(2012)05-0177-06

2011-09-28

哈爾濱市科技局科技創新人才專項基金項目(2011RFQXN056)；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12511409)

趙輝(1971—)，男，副教授，博士后，研究方向為發酵工程。E-mail：zhaohui9463@sohu.com