海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌條件優化

郭宇星，潘道東,2,*，劉 洋，王翠翠

(1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211)

海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌條件優化

郭宇星1，潘道東1,2,*，劉 洋1，王翠翠1

(1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211)

采用海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌，制備具有血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性的酸乳，通過單因素試驗和L9(34)正交試驗確定其最優固定條件。結果表明，最優固定條件是1.5g/100mL海藻酸鈉溶液、菌液濃度1:10(m/V)、0.1mol/L CaCl2溶液、固定時間1h。將固定化的瑞士乳桿菌與傳統酸乳發酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)復配接入到11g/100mL牛乳中，在37℃條件下發酵至凝乳，凝乳時間為8h，pH值為4.2，凝乳狀態好，口感柔和、細膩，成品酸乳ACE抑制活性為70.3%。

固定化；海藻酸鈉；瑞士乳桿菌；血管緊張素轉移酶抑制活性

血管緊張素轉化酶(angiotensin-I converting enzyme，EC3.4.15.1，ACE)抑制肽指的是一類具有抑制ACE活性的肽類物質。ACE抑制肽在人體血壓調節過程中起著重要的生理作用，所以又被稱作為降血壓肽。來源于乳蛋白的ACE抑制肽，其降壓效果雖不及合成藥物強烈，但無副作用，安全可靠[1-6]。乳源ACE抑制肽主要是乳蛋白質水解物和一些乳酸菌發酵乳制品，在眾多乳酸菌中，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)蛋白水解能力較強，制作的酸乳含有高活性的ACE抑制肽[7]。如Nakamura 等[8-9]用Lactobacillus helveticus和Saccharomyces cerevisiae作為發酵劑制作了一種名為Calpis的酸乳飲料，原發性高血壓小鼠(SHR)長期服用Calpis后，可抑制血壓上升。Yamamoto等[10]報道從瑞士乳桿菌CPN4菌株的發酵乳中分離到具有抑制ACE活性及降高血壓功能的乳蛋白水解肽。在國內，潘道東等[11-12]采用瑞士乳桿菌JCM1004制備酸乳，并且從酸乳中分離到ACE 抑制肽，通過SHR動物實驗表明此發酵乳抗血壓升高的作用比較顯著。

海藻酸鈉是由α-L-古洛糖醛酸鈉(α-L-guluronate，簡稱G )和β-D-甘露糖醛酸鈉(β-D-mannuronate，簡稱M) 1、4連接的長鏈線性多糖，海藻酸鹽分子鏈G塊容易與Ca2+作用，2條分子鏈G塊間形成一個洞，結合Ca2+外形成蛋盒模型，形成熱不可逆凝膠，具有較好的生物相容性和生物可降解性，從而將瑞士乳桿菌固定化在凝膠網絡中[13]。瑞士乳桿菌固定化后可重復使用，并可實現連續化或半連續化發酵生產ACE抑制肽[14-18]。

本實驗采用海藻酸鈉包埋法將瑞士乳桿菌固定，采用單因素與正交試驗確定海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌的最優工藝條件，以固定化瑞士乳桿菌為發酵劑制備高活性降血壓肽酸乳，旨在為降血壓肽的高效制備提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)15019 本實驗室篩選保藏；海藻酸鈉 成都市科龍化工試劑廠；Hip-His-Leu 美國Sigma公司；傳統酸乳發酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌) 市售；其他試劑均購自上海久億化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SA-910型超凈工作臺 上海上凈凈化設備有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；CL-22M高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HH-S11-2電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌單因素條件研究

1.3.1.1 海藻酸鈉質量濃度的選擇

以海藻酸鈉質量濃度1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/100mL的海藻酸鈉分別對瑞士乳桿菌進行固定化，0.100mol/L CaCl2作為聚凝劑，固定時間為2h，菌液濃度1:10，觀察其成珠狀況。以固定化瑞士乳桿菌酸乳凝乳時間、凝乳狀態為評價指標，確定最佳海藻酸鈉溶液質量濃度。

1.3.1.2 CaCl2溶液濃度的選擇

以濃度為0.050、0.075、0.100、0.125、0.150mol/L的CaCl2溶液作為聚凝劑，1.5g/100mL 海藻酸鈉為載體，菌液濃度1:10，固定化時間為2h進行瑞士乳桿菌固定化，觀察其成珠狀況。以固定化瑞士乳桿菌酸乳凝乳時間、凝乳狀態為評價指標，確定最佳CaCl2溶液濃度。

1.3.1.3 固定時間的選擇

以1.5g/100mL海藻酸鈉為載體，0.100mol/L CaCl2作為聚凝劑，菌液濃度1:10，對瑞士乳桿菌分別固定0、0.5、1.0、1.5、2.0h。以固定化瑞士乳桿菌酸乳凝乳時間、凝乳狀態為評價指標，確定最佳的固定化時間。

1.3.1.4 瑞士乳桿菌菌液濃度的選擇

選取菌液濃度1:5、1:10、1:15、1: 20、1:25、 1:30的瑞士乳桿菌菌液，以1.5g/100mL的海藻酸鈉為載體，0.100mol/L CaCl2作為聚凝劑，對瑞士乳桿菌固定1h。以固定化瑞士乳桿菌酸乳凝乳時間、凝乳狀態為評價指標，確定最佳的瑞士乳桿菌菌液濃度。

1.3.2 海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌條件優化

以海藻酸鈉溶液質量濃度、CaCl2溶液濃度、固定時間和瑞士乳桿菌菌體濃度做四因素三水平正交試驗(L9(34))，以固定化瑞士乳桿菌酸乳凝乳時間為評價指標，確定各因素對結果的影響大小，選出最優的固定方法，每個試驗做3組平行。

1.3.3 固定化瑞士乳桿菌制備富含ACE抑制肽酸奶

按照優化的海藻酸鈉固定化條件制備固定化瑞士乳桿菌，與傳統酸乳發酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)復配制備ACE抑制肽酸乳。采用Minitab 14軟件進行雙因子方差分析和主成分分析觀察固定化瑞士乳桿菌和傳統酸乳發酵劑對發酵酸乳感官、凝乳時間、pH值及ACE抑制活性的影響。

將乳粉配制成11g/100mL的復原乳，按一定比例接入酸乳發酵劑，37℃培養至凝乳取出，測定酸乳的凝乳時間、終產品pH值、ACE抑制活性、感官評分。酸乳發酵劑分4組：A組：未固定瑞士乳桿菌；B組：固定化瑞士乳桿菌；C組：未固定瑞士乳桿菌＋傳統酸乳發酵劑；D組：固定化瑞士乳桿菌＋傳統酸乳發酵劑，發酵劑總接種量都為體積分數3%。每組實驗做3組平行。

1.4 瑞士乳桿菌菌體制備

將瑞士乳桿菌菌體凍干粉(－80℃冷藏)接種于MRS培養基，連續活化3代，按3mL/100mL接種量接種于1L MRS培養基中，37℃條件下擴大培養至生長對數期取出，4℃、4500r/min離心20min收集菌體沉淀。用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液洗滌菌體，4℃、4500r/min離心20min棄上清液，重復洗滌3次，收集菌體備用。

1.5 海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌

取一定量的瑞士乳桿菌菌液加入到一定質量濃度的海藻酸鈉溶液中，用無菌玻璃棒攪拌均勻，靜置片刻，用10mL注射器吸取混合液，以10cm左右的高度逐滴注入到一定濃度的CaCl2溶液中，形成膠珠，浸泡一段時間使之固定化，然后取出用無菌生理鹽水洗去膠珠表面的CaCl2溶液，于4℃冰箱中貯存備用。

1.6 酸乳的制備

將11g乳粉緩慢加入到100mL溫度為50～60℃的熱水中，加熱至95℃，保溫20min進行殺菌處理，降至室溫備用。將發酵劑接入到11g/100mL復原乳中, 于37℃恒溫發酵至凝乳，記錄凝乳時間，觀察凝乳狀態，測定酸乳pH值，進行感官評分，測定酸乳ACE抑制肽活性。

1.7 指標測定

1.7.1 酸乳pH值測定

采用pH計進行精確測量。

1.7.2 感官評定方法

以口感、組織狀態、凝乳狀態為感官評定指標。由于這三者在評定酸乳產品質量中的重要性有所不同，故分別對其賦予不同的權重：口感30%，組織狀態30%，凝乳狀態40%。由8位具有感官評定經驗的評價人員進行評定，滿分為100分，具體感官評定標準參照表1。

表1 感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards

1.7.3 ACE抑制活性測定

采用Cushman等[19]的方法，用含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(pH8.3)將Hip-His-Leu配成5.0mmol/L的溶液。在10mL試管中加入200μL的5.0mmol/L Hip-His-Leu溶液和200μL樣品，于37℃保溫3min后，再加入20μLACE溶液(溶解于蒸餾水中，活力為0.1U/mL)，混勻后在37℃保溫30min，再加入250μL的1.0mol/L鹽酸溶液以終止反應，再加入1.7mL醋酸乙酯，經15s振蕩混勻后，靜置5min，用移液管吸取1.0mL醋酸乙酯層，120℃烘箱烘干，加入1.0mL蒸餾水，混勻后在228nm波長處測定吸光度。

式中：A為添加ACE抑制肽時，ACE和Hip-His-Leu反應的吸光度；B為不添加ACE抑制肽時，ACE和Hip-His-Leu反應的吸光度。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌單因素條件研究

2.1.1 海藻酸鈉質量濃度的選擇

表2 海藻酸鈉溶液質量濃度對成珠狀況的影響Table 2 Effect of sodium alginate concentration on microcapsule formation

圖1 海藻酸鈉溶液質量濃度對固定化瑞士乳桿菌活力的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on coagulation activity of immobilized Lactobacillus helveticus

海藻酸鈉溶液濃度會影響所成膠珠的大小，從而影響成膠強度和發酵速度。表2和圖1結果表明，海藻酸鈉溶液質量濃度為1.0g/100mL時，凝乳時間較短，該質量濃度時成珠較易，但成珠太軟，易破裂；海藻酸鈉溶液質量濃度為1.5g/100mL時，凝乳時間最短，其成珠也較容易，且膠珠強度適中，說明此時固定化瑞士乳桿菌活力較高；海藻酸鈉溶液質量濃度大于1.5g/100mL時，發酵速度變慢，凝乳時間延長，成珠也越困難，強度高，不利于生產使用。由此可見，海藻酸鈉質量濃度太小，凝膠的孔徑較大，固定化菌體容易流失，固定化效率不高，所以酸乳凝乳時間長。而當海藻酸鈉質量濃度過高，溶液黏性增強，固定化操作不便，且成珠困難，而且海藻酸鈉濃度越大，凝膠的孔徑越小，瑞士乳桿菌菌體和底物的接觸幾率越小。所以綜合考慮凝乳時間、成珠狀況，瑞士乳桿菌固定化選用質量濃度1.5g/100mL的海藻酸鈉溶液包埋為宜。

2.1.2 CaCl2溶液濃度的選擇

表3 CaCl2溶液濃度對成珠狀況的影響Table 3 Effects of CaCl2 concentration on microcapsule formation

CaCl2溶液的濃度影響凝膠珠的凝固時間以及凝膠珠的表面強度。CaCl2中的鈣離子與海藻酸根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細胞固定。表3和圖2結果表明，用濃度為0.1mol/L CaCl2溶液作為聚凝劑時成珠容易，硬度適中，凝乳時間較短。隨著CaCl2濃度的增加，酸乳凝乳時間變長，說明固定化瑞士乳桿菌活力較低，可能是由于鹽的高滲透壓作用引起細胞脫水，致使微生物活性部分喪失，也可能由于過高的CaC12濃度使得海藻酸鈉網格狀結構致密，使底物向內擴散和產物向外擴散變得更加困難，表觀為凝乳時間變長。CaC12量太少又會導致凝膠強度太小，包埋不完全，從圖中也可以看到，CaCl2濃度小于0.1mol/L時，酸乳凝乳時間較長。綜合考慮成珠狀況以及凝乳時間，瑞士乳桿菌固定化采用0.1mol/L CaCl2作為聚凝劑為宜。

圖2 CaCl2溶液濃度對固定化瑞士乳桿菌活力的影響Fig.2 Effect of CaCl2 concentration on coagulation activity of immobilized Lactobacillus helveticus

2.1.3 固定時間的選擇

圖3 固定時間對固定化瑞士乳桿菌活力的影響Fig.3 Effect of immobilization duration on coagulation activity of immobilized Lactobacillus helveticus

海藻酸鈉在CaCl2溶液中交聯的時間長短也會對固定化瑞士乳桿菌細胞活性產生影響。由圖3可見，固定時間小于1h時，由于固定時間太短，凝膠強度太小，包埋不完全，瑞士乳桿菌活性較低，表現為酸乳凝乳時間較長。固定時間為1h時，凝膠小球強度合適，凝乳時間最短，說明此時瑞士乳桿菌包埋量最適。當固定時間繼續延長時，酸乳凝乳時間反而下降，而且所得固定化凝膠小球的強度越高，說明凝膠小球內部的結構緊密，不利于基質的傳遞，從而使細胞失活率增大。這與唐三三等[20]報道的相一致，海藻酸鈉與CaC12形成凝膠是Ca2+通過海藻酸鈉膠囊由外向內置換Na+而形成海藻酸鈣，因而需要一定量的置換時間，但如果固定化時間太長，交聯程度高，形成的凝膠結構太緊密，從而影響到反應速率。

2.1.4 瑞士乳桿菌菌液濃度的選擇

圖4 瑞士乳桿菌菌液濃度的選擇Fig.4 Effect of Lactobacillus helveticus cell concentration on its coagulation activity

由于海藻酸鈣小球容積一定，瑞士乳桿菌菌體包埋量也是一定的。由圖4可知，當瑞士乳桿菌菌液濃度為1:10時，酸乳凝乳時間最短，此時再增加瑞士乳桿菌菌體，凝乳時間也不再變化，說明在此實驗條件下瑞士乳桿菌飽和菌濃為1:10。

2.2 固定化瑞士乳桿菌條件優化

表4 L9(34)正交試驗表Table 4 L9(34) orthogonal experimental design table

從表4可知，各因素對固定化瑞士乳桿菌發酵酸乳凝乳時間影響的主次順序依次為：D＞C＞B＞A，即菌液濃度＞固定時間＞CaCl2溶液濃度＞海藻酸鈉溶液質量濃度。最優固定化瑞士乳桿菌條件為A1B2C1D1和A2B2C1D1，在9組試驗中，最優的固定化條件為A2B2C1D1，故進行驗證實驗，實驗重復3次。在A1B2C1D1條件下，固定化瑞士乳桿菌凝乳時間為(9.5±0.15)h，在A2B2C1D1條件下凝乳時間為(10.0±0.15)h。故最后確定海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌的條件為海藻酸鈉溶液質量濃度1.5g/100mL，CaCl2濃度0.1mol/L，固定化時間1h，瑞士乳桿菌菌液濃度1:10。

2.3 固定化瑞士乳桿菌制備富含ACE抑制肽酸乳

圖5 海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌制備酸乳的凝乳實驗Fig.5 Comparison of properties of yogurts made using different fermentation starters

由圖5可知，采用海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌制備的酸乳ACE抑制活性為70.3%，與未固定化瑞士乳桿菌制備的酸乳ACE抑制活性相比有所提高。但用單一瑞士乳桿菌發酵酸乳，酸乳凝乳時間較長，凝乳狀態不好，而且有大量的乳清析出，而將瑞士乳桿菌與傳統酸乳發酵劑進行復配發酵，酸乳凝乳時間縮短了近4h，酸乳pH值由原來5.3降至4.8，并且感官評分也較高，產品ACE抑制活性不受影響。從表5可以看到，瑞士乳桿菌有無固定化對酸乳ACE抑制活性有顯著影響；而有無添加傳統酸乳發酵劑對酸乳的感官評分和pH值有顯著影響。綜上，固定化瑞士乳桿菌對于酸乳的ACE抑制活性有較大影響，傳統酸乳發酵劑對酸乳品質有較大影響，添加傳統酸乳發酵劑可提高酸乳的凝乳時間、降低酸乳pH值、提高其感官品質。所以，采用固定化瑞士乳桿菌和傳統酸乳發酵劑共同發酵，可制備出具有高ACE抑制活性，且感官品質良好的酸乳。

表5 凝乳實驗雙因子方差分析P值Table 5 P-value obtained in two-way ANOVA

3 結 論

瑞士乳桿菌是近些年研究較多的用于制備ACE抑制肽的菌種，但采用游離瑞士乳桿菌不能連續生產ACE抑制肽，例如瑞士乳桿菌每次需活化、擴大培養后制成工作發酵劑才能使用；終產品分離提純也較繁瑣。因此，本實驗通過單因素和正交試驗確定了海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌的最優條件為：海藻酸鈉溶液質量濃度1.5g/100mL，CaCl2溶液濃度為0.1mol/L，固定化時間為1h，瑞士乳桿菌菌液濃度為1:10，并得到影響海藻酸鈉固定化瑞士乳桿菌條件的各因素主次順序依次為：瑞士乳桿菌菌液濃度＞固定時間＞CaCl2溶液濃度＞海藻酸鈉溶液質量濃度。

以固定化瑞士乳桿菌為發酵劑制備高活性降血壓肽酸乳，得到固定化瑞士乳桿菌制備富含ACE抑制肽酸奶的最佳工藝條件為：將乳粉配制成11g/100mL的復原乳，接入固定化瑞士乳桿菌和傳統酸乳發酵劑，在37℃培養至凝乳取出，凝乳時間為8h，pH值為4.2，凝乳狀態好，口感柔和、細膩，ACE抑制活性為70.3%。

綜上，采用海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌制備高ACE抑制活性的酸奶是可行的，此項工作為降血壓肽的高效制備提供了研究基礎。后續工作將開展固定化瑞士乳桿菌生物反應器的研究，用于連續生產ACE抑制肽，這對功能性食品市場的開發具有一定的意義。

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Optimization of Conditions for Immobilization ofLactobacillus helveticusUsing Sodium Alginate

GUO Yu-xing1，PAN Dao-dong1,2,*，LIU Yang1，WANG Cui-cui1
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study,Lactobacillus helveticuswas immobilized using sodium alginate and used to product yogurt with ACE inhibitory activity. As determined using one-factor-at-a-time method in combination with an L9(34) orthogonal array design, the optimal immobilization conditions were sodium alginate concentration 1.5 g/100 mL, cell concentration 1:10 (m/V), CaCl2 concentration 0.1 mol/L, and immobilization time 1 h. The immobilized strain and traditional yogurt starter consisting ofLactobacillus bulgaricusandStreptococcus thermophiluswere used together to ferment 11 g/100 mL milk power solution at 37 ℃until coagulation was completed. Good coagulation was achieved after 8 h of fermentation. The pH of the yogurt obtained with a gentle and smooth taste was 4.2 and the ACE inhibitory activity 70.3%.

immobilization；sodium alginate；Lactobacillus helveticus；ACE inhibitingactivity

TS252.54

A

1002-6630(2012)05-0188-05

2011-06-29

國家自然科學基金青年科學基金項目(31101314)；江蘇省自然科學基金項目(BK2011787)；江蘇省教育廳高校自然科學基金項目(10KJB550003)；南京師范大學特聘教授、高層次人才科研啟動基金項目(184070H2B08)

郭宇星(1981—)，女，講師，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：yuxingguo1981@yahoo.com.cn

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：daodongpan@163.com