響應曲面法優化酶解條件制備乳源ACE抑制肽

徐 鑫，蔡麗麗，劉國艷，何佳易，魏曉蕊，王之穎，張 軍

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2. 揚州大學實驗農牧場，江蘇 揚州 225001)

響應曲面法優化酶解條件制備乳源ACE抑制肽

徐 鑫1，蔡麗麗1，劉國艷1，何佳易1，魏曉蕊1，王之穎1，張 軍2

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2. 揚州大學實驗農牧場，江蘇 揚州 225001)

采用響應曲面法優化胰蛋白酶(PTN6.0S)酶解酪蛋白酸鈉的工藝條件，制備高活性的血管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽。利用準確度更高的RP-HPLC法測定酶解產物的ACE抑制率，通過單因素和響應面試驗設計，分別考察pH值、溫度、時間、底物質量濃度、酶與底物比等因素對ACE抑制肽活性的影響。結果顯示：響應曲面法優化酶解條件得到數學模型為：抑制率/%＝－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－0.054526A2－0.079754B2－0.53587C2－0.28096D2，確定最佳工藝條件為pH7.0、溫度52.31℃、時間19.44h、底物質量濃度5.91g/100mL、酶與底物比8.37‰，此時ACE抑制率達97.11%。關鍵詞：酪蛋白酸鈉；胰蛋白酶；ACE抑制肽；響應曲面法；RP-HPLC

高血壓已在世界范圍內成為發病率最高的慢性疾病之一[1]，也是心血管疾病最主要的誘因[2]，嚴重危害人體健康。近年來，各國學者從不同食物蛋白酶解產物中相繼發現具有血壓調節功能的安全、無副作用的血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽[3-10]。酪蛋白酸鈉是一種富含生物活性肽的蛋白質，其蛋白結構與酪蛋白相似且溶解性明顯優于后者，它在特異性蛋白酶作用下能釋放出諸如類阿片肽、免疫調節活性肽、ACE抑制肽等生物活性肽是酶解的優良底物[11-12]。此外，選擇適宜的酶進行酶解能夠使產物的生物活性最大化，胰蛋白酶專一性相對較高，在制備生物活性肽的同時又可以改善蛋白的消化作用，降低蛋白的致敏性[6]。

本實驗選用酪蛋白酸鈉為原料，經胰蛋白酶(PTN6.0S)酶解，采用RP-HPLC法測定酶解產物的ACE抑制率，通過單因素及響應曲面試驗優化酶解條件，為ACE抑制肽的研究開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白酸鈉(蛋白含量87%) 新西蘭恒天然公司；胰蛋白酶PTN6.0S(酶活力1.89×104U/g) 丹麥諾維信公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、血管緊張素轉換酶(ACE)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、馬尿酸(HA)美國Sigma公司；水、甲醇和三氟乙酸(TFA)均為HPLC級。

1.2 儀器與設備

524型恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦公司； RV 10基本型旋轉蒸發儀 德國IKA公司；5804R高速離心機 德國Eppendorf公司；Delta320pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Alphal-2 LD Plus冷凍干燥機 德國Christ公司；LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A UV/Vis紫外檢測器 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE抑制多肽樣品制備工藝

酪蛋白酸鈉→雙蒸水溶解→加酶→恒溫酶解→滅酶(沸水浴，10min)→離心(10000r/min，4℃，15min)→取上清液→旋轉蒸發濃縮→冷凍干燥→凍干粉

1.3.2 酶解工藝條件的單因素試驗設計

依據所用酶的最佳酶解條件以及前期實驗的結果，設定固定酶解溫度50℃、時間8h、底物質量濃度3g/100mL、pH7.0，酶與底物比1‰中的4個因素，改變其中1個因素，進行單因素試驗，各因素梯度設計為：溫度35、40、45、50、55、60、65℃；時間3、8、13、18、23、28、33h；底物質量濃度1、2、3、4、5、6、7g/100mL；酶與底物比0.1‰、0.2‰、0.4‰、1‰、2‰、4‰、10‰，pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.3 酶解工藝條件的響應曲面試驗設計

根據Box-Behnken設計原理，以酶解產物的ACE抑制率為響應值，選取溫度、時間、底物質量濃度、酶與底物比為影響因素，進行四因素三水平分析，共29個試驗點，其中5個為中心點，具體設計見表1。

表1 酶解工藝條件的響應曲面試驗設計表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 ACE抑制活性的測定

將HHL和ACE分別溶于pH8.3的HEPES緩沖液。取10μL的ACE溶液和50μL樣品(0.05g/L)混合置于37℃水浴5min，然后于同一溫度下加入80μL的HHL溶液水浴反應30min，最后在混合體系中加入200μL HCl(1mol/L)終止反應，樣品經0.22μm的濾膜過濾后進樣[13-18]。

色譜條件：Intertsil ODS-SP柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：體積分數50%甲醇，其中包含0.1% TFA，流速：1mL/min，檢測波長：228nm；柱溫：25℃；檢測時間：20min；進樣量：10μL；定量方法：外標法。抑制率用下式計算。

式中：Ec是ACE抑制劑不參加反應的條件下測得的吸光度(空白樣品組)；Es是ACE及ACE抑制劑都存在條件下測得的吸光度(樣品組)；Eb是ACE不參與反應的條件下的吸光度(底物HHL組)。

1.4 數據處理

響應曲面試驗數據采用Design Expert 7.0軟件繪圖并作方差和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素酶解試驗結果

2.1.1 酶解溫度對ACE抑制率的影響

圖1 酶解溫度對ACE抑制活性的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

由圖1可知，50℃時ACE抑制率最高，偏離此溫度抑制率會發生不同程度的降低，這與胰蛋白酶(PTN6.0S)的最適作用溫度相符合。據此，在響應曲面試驗設計中選擇50℃為中心溫度。

2.1.2 酶解時間對ACE抑制率的影響

如圖2所示，ACE抑制率在0～8h內逐漸上升，8～18h內穩步下降，18～33h內下降速度加快。因此，確定8h為最佳酶解時間。據Mullally等[19]報道，在最初的酶解階段，ACE抑制活性肽能夠被逐步釋放出來，但是進一步降解并不能使ACE抑制活性得到進一步的提升。長時間的酶解可能會使ACE抑制肽進一步降解，由此減弱了產物的ACE抑制活性。

圖2 酶解時間對ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

2.1.3 底物質量濃度對ACE抑制率的影響

圖3 底物質量濃度對ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如圖3所示，底物質量濃度在1～4g/100mL范圍內，ACE抑制率隨著底物質量濃度的增加而上升，之后底物質量濃度增加，ACE抑制率逐漸降低。有報道顯示與此相一致的趨勢[20-22]，底物質量濃度的增加對酶有抑制作用，即多個底物分子可能占據了酶的部分活性位點，使酶不能發揮很好的效果。據此，在響應曲面試驗設計中選擇4g/100mL為中心底物質量濃度。

2.1.4 酶與底物比對ACE抑制率的影響

圖4 酶與底物比對ACE抑制活性的影響Fig.4 Effect of ratio of enzyme to substrate on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如圖4所示，酶與底物比也是影響酶解產物ACE抑制率的重要因素，隨著酶量的增加，ACE抑制率上升，酶與底物比在0.1‰～4‰范圍內，ACE抑制率上升趨勢很明顯。據此，考慮實驗成本等因素，在響應曲面試驗設計中選擇5.5‰為中心酶與底物比。

2.1.5 pH值對ACE抑制率的影響

圖5 pH值對ACE抑制活性的影響Fig.5 Effect of pH on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如圖5所示，pH值對酶解產物的ACE抑制率影響較小，而在活性測定中pH值會對測定結果產生較大干擾。綜合考慮后，在響應曲面設計中，固定pH值為7.0，不考慮pH值的變化對酶解產物ACE抑制率的影響。

2.1.6 RP-HPLC色譜圖

圖6 標準樣馬尿酸(HA)色譜圖Fig.6 Chromatograms of hippuric acid standard

圖7 空白樣色譜圖Fig.7 Chromatograms of control sample

由圖6可知，馬尿酸(HA)標樣出峰時間在5.150min，圖7所示的空白樣品在相同保留時間也出峰，通過對HA峰面積的計算，可以精確計算出不同樣品的ACE抑制率。

2.2 響應曲面法優化酶解條件結果

2.2.1 響應曲面試驗結果

由表2可知，根據回歸模型的顯著性剔除了不顯著交互項AC和CD，分析結果顯示，模型的F值為15.89，P＜0.01，表明該回歸模型顯著。失擬項的P值為0.174，說明失擬不顯著，該模型有較好的擬合度。根據回歸系數，可得二次多項回歸方程：抑制率/%＝－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－0.054526A2－0.079754B2－0.53587C2－0.28096D2。回歸系數的顯著性分析結果表明，C項(P＝0.0004)、D、A2、B2、D2項均P＜0.01，均為顯著項。

表2 響應曲面法優化酶解條件的試驗設計與結果Table 2 Test design and results of hydrolysis condition optimization by response surface methods

2.2.2 響應曲面分析與條件優化

圖8列出了各因素間交互作用的響應曲面圖(CD、AC項不顯著，被剔除)。由曲面的彎曲程度和等高線可以看出，圖8a中，溫度一定時，ACE抑制率隨時間先上升后下降，不同溫度條件下，ACE抑制率對時間的變化也呈現先上升后下降的趨勢；圖8b中，溫度和酶與底物比對ACE抑制率的影響效果明顯，均表現出先上升后下降的趨勢；圖8c中，底物質量濃度對ACE抑制率變化較小，總體較平緩，時間對其影響較明顯；圖8d顯示，酶與底物比和時間對ACE抑制率的影響效果相近。

圖8 酶與底物比、時間、溫度、底物質量濃度交互影響ACE抑制率的響應曲面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four hydrolysis parameters on ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

模型優化的最佳酶解條件為：溫度52.31℃、時間19.44h、底物質量濃度5.91g/100mL、酶與底物比8.37‰，用胰蛋白酶在體系為pH7.0時酶解酪蛋白酸鈉，多肽產物ACE抑制率為97.11%。

采用優化的條件對酶解酪蛋白酸鈉進行重復性實驗，為方便操作，條件設為溫度52℃、時間19h、底物質量濃度6g/100mL、酶與底物比8‰、pH7.0，結果發現，該條件下得到多肽的ACE抑制率為96.5%，與模型估計值97.11%相比，相對誤差為0.628%，說明采用響應曲面法優化得到的酶解工藝條件參數準確可靠，利用本實驗建立的模型在實踐中進行預測是可行的。

3 結 論

本實驗結果顯示，多肽的體外ACE抑制活性與酶解條件并非簡單的線性關系，各因素間的交互作用明顯。胰蛋白酶酶解酪蛋白酸鈉制備ACE抑制肽的最優工藝為：pH7.0的體系下，溫度52.31℃、時間19.44h、底物質量濃度5.91g/100mL、酶與底物比8.37‰。此時，獲得的多肽ACE抑制率最高，達97.11%。驗證實驗表明優化出的最佳工藝具有較好的可重現性。

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Response Surface Methodology for Optimization of Hydrolysis Conditions for the Production of Milk-derived Angiotensin-I Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Peptides

XU Xin1，CAI Li-li1，LIU Guo-yan1，HE Jia-yi1，WEI Xiao-rui1，WANG Zhi-ying1，ZHANG Jun2
(1. School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；
2. Farm of Experiment, Yangzhou University, Yangzhou 225001, China)

In our present study, response surface methodology was used to optimize process conditions for the hydrolysis of sodium caseinate by trypsin to prepare highly active angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides. ACE inhibitory rate was measured by RP-HPLC. One-factor-at-a-time method followed by response surface analysis was used to analyze the effects of pH, temperature, hydrolysis time, substrate concentration, enzyme/substrate ratio on ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate. A mathematical model describing the relationship of ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate with temperature (A), hydrolysis time (B), substrate concentration (C) and enzyme/substrate ratio (D) was obtained as follows:Y=－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－ 0.054526A2－ 0.079754B2－ 0.53587C2－ 0.28096D2. The optimum hydrolysis conditions were determined as pH 7.0, 52.31 ℃, 19.44 h, substrate concentration of 5.91 g/100 mL and enzyme/substrate ratio of 8.37‰, resulting in an ACE inhibitory rate of 97.11%.

sodium caseinate；trypsin；ACE inhibiting peptides；response surface methodology；RP-HPLC

TS218

A

1002-6630(2012)05-0208-05

2011-04-28

江蘇省高校自然科學基礎研究項目(08KJD550004)；揚州市-揚州大學合作基金項目(YZ2008089)；江蘇省科技型中小企業技術創新資金項目(BN2008207)；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(CXLX11_1017)

徐鑫(1977—)，男，副教授，博士，研究方向為功能性食品資源開發與利用。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn