海帶巖藻聚糖硫酸酯對小鼠的免疫調節作用

李 芳，李八方，王景峰，張 晶，李 堯，趙 雪*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

海帶巖藻聚糖硫酸酯對小鼠的免疫調節作用

李 芳，李八方，王景峰，張 晶，李 堯，趙 雪*

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

目的：采用免疫學評價方法，研究海帶巖藻聚糖硫酸酯對小鼠免疫功能的調節作用。方法：以海帶粗多糖為原料，采用酸提取、離子交換和自由基氧化降解法制備得到不同的巖藻聚糖硫酸酯組分。KM小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組和海帶巖藻聚糖硫酸酯組分F-2、Fa和Fb的低、中、高劑量組。除正常組外，其余皮下注射氫化可的松造成免疫低下模型后灌胃。海帶巖藻聚糖硫酸酯F-2、Fa和Fb組小鼠分別灌胃F-2、Fa和Fb不同劑量多糖溶液(分別為25、50、100mg/(kg·d))，陽性對照組灌胃鹽酸左旋咪唑(20mg/(kg·d))，進行免疫指標的測定。結果：F-2、Fa和Fb組均能顯著提高免疫低下小鼠的脾臟質量/體質量比值，提高血清溶血素含量和提高腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力，且F-2和Fa組能增強遲發型變態反應能力，但Fb組對遲發型變態反應能力無顯著性影響。結論：海帶巖藻聚糖硫酸酯對免疫低下小鼠具有較好的免疫調節作用，且中、低分子質量的巖藻聚糖硫酸酯對免疫低下小鼠的免疫調節作用沒有顯著性差異。

海帶巖藻聚糖硫酸酯；免疫低下小鼠；免疫調節

巖藻聚糖硫酸酯是一種來源于海洋藻類、海洋無脊椎動物和被囊動物中富含巖藻糖的硫酸多糖，具有抗病毒、抗凝血、抗血栓、抗腫瘤等生物活性[1-3]。研究發現，海帶硫酸多糖可增強正常小鼠和免疫低下小鼠的免疫功能，具有體外促進淋巴細胞增殖和亞群分化的作用，其免疫調節作用對艾滋病患者的免疫重建具有重要的作用[4-7]，而且海帶硫酸多糖對小鼠肉瘤S180的抑制活性可能與其對巨噬細胞的激活有關[8]。但是目前的研究大多是高分子質量的巖藻聚糖硫酸酯的免疫調節活性。

本實驗采用酸提取和自由基氧化降解制備中分子質量和低分子質量的海帶巖藻聚糖硫酸酯，比較不同分子質量的巖藻聚糖硫酸酯對小鼠免疫功能的影響，為相對低分子質量巖藻聚糖硫酸酯在免疫調節方面的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan)粗多糖 日照潔晶海洋生物技術有限公司。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(分析純)、D-甘露糖、D-葡萄糖 上海化學試劑公司；右旋糖酐分子質量標準品(180、2.5、4.6、7.1、10kD) 中國藥品生物制品檢定所；D-(＋)-氨基葡萄糖(GlcN)、D-葡萄糖醛酸(GlcUA) 美國Fluka公司；L-鼠李糖、D-半乳糖、乳糖、D-木糖和L-巖藻糖 美國Sigma公司；氫化可的松 西安利君制藥有限責任公司；鹽酸左旋咪唑 山東省仁和堂藥業有限公司。

1.2 實驗動物與細胞

健康KM小鼠，雌性，體質量18～22g，SPF級，購自青島市藥品檢驗所，動物合格證號：SCXK(魯)20090007；健康豚鼠，雌性，體質量350～400g，購自青島市藥品檢驗所，動物合格證號：S C X K(魯)20090009，抽取心臟血，分離血清，經壓積綿羊紅細胞吸收后，作為本實驗的補體來源；綿羊紅細胞(sheep red blood cell，SRBC)，由濟南百博生物技術有限責任公司提供無菌脫纖維羊血，按常規方法制備SRBC懸液[9]；雞紅細胞(chicken red blood cell，CRBC)，市售公雞，抽取雞翼靜脈血，按常規方法制備CRBC懸液。

1.3 儀器與設備

中空纖維超濾膜(截留分子質量10kD和6kD) 天津膜天膜工程技術有限公司；超濾膜(2.5kD和300D) 美國GE公司；Agilent 1100 高效液相色譜儀 美國Agilent公司；HPG-32OH人工氣候培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；XSE-4G生物顯微鏡 美國Sigma公司；游標卡尺(精度為0.01mm) 海信威量量具有限公司；Q-Sepharose FF 陰離子交換色譜柱分離 Amersham Pharmacia Biotech公司；ICS-2000離子色譜系統 美國Dionex公司；TSK-gel G3000 PWxl 色譜柱、TSK-gel G2500 PWxl 日本Tosoh Bioscience公司。

1.4 方法

1.4.1 中分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備

巖藻聚糖硫酸酯粗多糖采用 Q-Sepharose FF陰離子交換色譜柱分離，分別用0、0.5、1、2.5mol/L NaCl溶液分步洗脫，收集2.5mol/L NaCl溶液洗脫得到的高硫組分F-2，用截留分子質量為10kD的中空纖維超濾膜超濾脫鹽，濃縮凍干。

1.4.2 低分子質量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備

取4.5g的巖藻聚糖硫酸酯粗多糖溶于水，配制成100mg/mL溶液，然后加入Cu(AC)2·H2O至Cu2+濃度為0.0267mol/L，調pH值至7.5左右。水浴加熱至溶液溫度為60℃，然后以12mL/h的速度加入4.5% H2O2溶液。降解5h后，停止加入H2O2，選用截留分子質量為10、6kD和2.5kD的超濾膜分離降解產物，得到兩個低分子質量組分Fa(6～10kD)、Fb(2.5～6kD)，然后分別濃縮凍干[10]。

1.4.3 分子質量的測定

采用高效液相色譜法[11]，中分子質量巖藻聚糖硫酸酯采用TSK-gel G3000 PWxl 色譜柱分析；低分子質量組分采用TSK-gel G2500 PWxl 色譜柱分析。采用Agillent GPC軟件計算各洗脫峰的重均分子質量(Mw)、數均分子質量(Mn)以及多分散系數D＝Mw/Mn。

1.4.4 硫酸根含量測定

采用離子色譜法[12]，選用ICS-2000 離子色譜系統，用Ionpac AS11-HC(4mm×250mm)色譜柱測定。

1.4.5 單糖組成測定

采用柱前衍生高效液相色譜法[13-14]，并按照參考文獻[15]制備各組分的單糖衍生物，選用ZORBAX Eclipse XDB-C18分離柱(4.6mm×250mm，5μm)進行分析。

1.4.6 動物分組及實驗

KM小鼠，隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組和海帶巖藻聚糖硫酸酯組分F-2、Fa和Fb的低、中、高劑量組，每組10只，組間平均體質量相近。小鼠分別灌胃不同劑量的海帶巖藻聚糖硫酸酯溶液(分別為25、50、100mg/(kg·d))，陽性對照組灌胃鹽酸左旋咪唑(20mg/(kg·d))，正常對照組和模型對照組灌胃生理鹽水，灌胃劑量為0.01mL/(g·d)，所有組均連續灌胃28d。除正常對照組外，其余各組均于首次給藥后第21天皮下注射氫化可的松15mg/(kg·d)，連續注射6d，正常小鼠皮下注射等量生理鹽水。于末次給藥后，禁食不禁水12h后，進行各免疫指標的測定[16]。

1.4.7 胸腺質量/體質量、脾質量/體質量比值測定

KM小鼠于末次給藥后，禁食不禁水12h，分別稱其質量，脫頸椎處死，剝離脾臟稱其質量并計算脾臟質量/體質量和胸腺質量/體質量比值測定。

1.4.8 血清溶血素抗體生成測定

KM小鼠于首次給藥后第23天，每只腹腔注射0.2mL體積分數10%的SRBC致敏。于末次給藥后12h，摘眼球收集血液。分離血清，按體積比1:200生理鹽水稀釋。按文獻[17]方法測定小鼠血清溶血素含量，計算半數溶血值(HC50)。

1.4.9 遲發型變態反應測定

KM小鼠致敏方法同1.4.8節。于末次給藥后在測量部位足墊用20μL體積分數20%的SRBC再次攻擊左后足趾，24h后脫頸椎處死，分別剪下左后足與右后足，同時測量左后足與右后足質量，并計算攻擊前后左后足與右后足質量的差值[18]。

1.4.10 腹腔巨噬細胞吞噬能力測定

KM小鼠于末次給藥后12h，每鼠腹腔注射1mL 2%雞紅細胞懸液，30min后脫頸椎處死。小鼠腹腔巨噬細胞的收集、染色和計數參見文獻[19]方法。

1.4.11 統計學處理

采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析，進行Least-Significant Difference(LSD)比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 巖藻聚糖硫酸酯化學性質的比較

圖1 低分子質量組分Fa和Fb的分子質量測定曲線Fig.1 HPLC chromatograms of fucoidan fractions (Fa and Fb) with low weights

表1 巖藻聚糖硫酸酯各組分的分子質量和硫酸根含量的比較Table 1 Comparison of molecular weights and sulfated ester contents of different fucoidan fractions

如圖1、表1所示采用酸提取法可以將高分子質量的巖藻聚糖硫酸酯(200kD)降解，得到的高硫中分子質量巖藻聚糖硫酸酯組分F-2分子質量為35kD，多分散系數較大，說明其為多個組分的混合物。F-2主要含有巖藻糖(46.20%)、甘露糖(19.75%)和半乳糖(12.36%)，還含有一定量的鼠李糖、木糖和D-葡萄糖醛酸。而巖藻聚糖硫酸酯粗多糖經自由基氧化降解后，得到的重均分子質量為7.68kD組分(Fa組分)在高效液相色譜分析中呈單一對稱峰，且分布范圍較窄，組分較純(圖1)，主要由巖藻糖組成，達到64.25%，其次是半乳糖含量上升到30.74%(表2)，巖藻糖和半乳糖占總單糖組成的94.99%，而甘露糖、鼠李糖和葡萄糖含量很低。而3.89kD的組分主要由重均分子質量為6.52kD和4.73kD的兩個組分組成，采用TSK2500色譜柱也無法分離，其硫酸根含量最高，達到32.48%，主要由巖藻糖(46.94%)和半乳糖(37.35%)組成，巖藻糖含量明顯低于7.68kD的組分。

表2 巖藻聚糖硫酸酯各組分組成單糖的物質的量比例Table 2 Comparison of molar proportion of monosacchrides in different fucoidan fractions

2.2 巖藻聚糖硫酸酯對小鼠脾質量/體質量和胸腺質量/體質量比值的影響

由表3可見，注射氫化可的松后，小鼠脾質量/體質量和胸腺質量/體質量比值均明顯降低。與模型對照組比較，灌胃50mg/kg和100mg/kg的 Fb組分可以顯著提高小鼠脾臟質量/體質量比值(P＜0.05)，而灌胃100mg/kg 的F-2和Fa組分均能顯著提高小鼠脾臟質量/體質量比值(P＜0.01，P＜0.05)。但是F-2、Fa和Fb各劑量組對胸腺質量/體質量比值均無顯著性影響(P＞0.05)。

2.3 對小鼠血清溶血素水平的影響

由表3可見，與模型對照組相比，F-2組分可顯著提高免疫低下小鼠血清溶血素含量，灌胃50mg/kg和100mg/kg F-2組分，其半數溶血值分別提高了17.37%和23.02%。Fa(100mg/kg)和Fb(50mg/kg)組分也能顯著提高小鼠半數溶血值，與模型組比較半數溶血值分別提高了23.27%和14.53%。但是不同分子質量的巖藻聚糖硫酸酯組分之間沒有顯著性差異。

2.4 對小鼠遲發型變態反應的影響

由表3可見，與模型對照組相比，F-2和Fa組分均分別灌胃50mg/kg和100mg/kg巖藻聚糖硫酸酯均能顯著增強小鼠的遲發型變態反應能力(P＜0.05，P＜0.01)，分別提高了35.25%、28.81%、32.72%和48.48%。而分子質量為3.89kD組分Fb各劑量組對小鼠遲發型變態反應均無顯著性影響。

表3 不同海帶巖藻聚糖硫酸酯組分對免疫低下模型小鼠免疫功能的影響(±s，n＝10)Table 3 Effects of fucoidan fractions on immune function of immunodepression mice (±s，n ＝ 10)

表3 不同海帶巖藻聚糖硫酸酯組分對免疫低下模型小鼠免疫功能的影響(±s，n＝10)Table 3 Effects of fucoidan fractions on immune function of immunodepression mice (±s，n ＝ 10)

注： ##.與正常對照組相比較，有極顯著差異(P＜0.01)；*.與模型對照組相比較，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與模型對照組相比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別 劑量/(mg/(kg·d)) 脾質量/體質量/(mg/kg) 胸腺質量/體質量/(mg/kg) 半數溶血值(HC50) 遲發型變態反應/mg正常對照組 5.52± 0.67 1.67± 0.24 83.74± 11.52 22.79± 2.27模型對照組 3.21± 0.5 0.51± 0.14## 61.59±12.28## 11.49±2.05##陽性對照組 20 3.52± 0.66 0.76± 0.31 73.64± 10.50* 17.18±1.86**25 3.68± 0.78 0.56± 0.16 69.78± 12.03 13.33± 4.38 F-2組 50 3.98± 0.83 0.53± 0.13 72.29±9.51* 15.54± 3.87**100 4.34± 0.97** 0.61± 0.11 75.77±6.53** 14.8±2.18*25 3.35± 0.22 0.62± 0.12 71.01± 9.11 12.23± 6.61 Fa組 50 3.44± 0.56 0.65± 0.18 73.77±14.68 15.25± 3.43*100 3.67± 0.53* 0.55± 0.12 75.92±12.91* 17.06±3.80**25 3.45± 1.14 0.62± 0.12 68.89± 13.64 13.00± 4.40 Fb組 50 3.55± 0.49* 0.65± 0.18 70.54±4.68* 13.99± 3.26 100 3.77± 0.46* 0.55± 0.12 69.73±14.59 13.825±3.97

2.5 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

表4 不同海帶巖藻聚糖硫酸酯組分對免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響(±s，n＝10)Table 4 Effects of fucoidan fractions on phagocytic functions of immunodepressed mice (±s，n ＝ 10)

表4 不同海帶巖藻聚糖硫酸酯組分對免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響(±s，n＝10)Table 4 Effects of fucoidan fractions on phagocytic functions of immunodepressed mice (±s，n ＝ 10)

組別 劑量/(mg/(kg·d)) 吞噬指數 吞噬率/%正常對照組 0.35± 0.03 24.67± 1.94模型對照組 0.24± 0.07## 15.90±4.48##陽性對照組 20 0.3± 0.05* 20.10± 2.69*25 0.29±0.09 18.50±3.92 F-2組 50 0.31± 0.06* 23.80±3.97**100 0.32± 0.09* 24.60±3.78**25 0.33±0.09* 21.33± 4.21*Fa組 50 0.33± 0.08* 21.56±4.93*100 0.35± 0.06** 22.30±4.59**25 0.28±0.06 18.60±3.63 Fb組 50 0.29± 0.07 22.20±2.66**100 0.39± 0.11** 23.63±3.62**

從表4可以看出，F-2及自由基氧化得到的低分子質量組分Fa和Fb均能夠顯著提高免疫低下小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力(P＜0.05，P＜0.01)。其中F-2(50mg/kg和100mg/kg)、Fa(50mg/kg和100mg/kg)和Fb(100mg/kg)均可以顯著提高腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數。

3 討論與結論

大量研究表明，多糖及其衍生物具有很好的免疫調節作用，而對正常細胞沒有毒性，屬于具有較強的絲裂原樣活性的生物反應調節劑[20]。海帶多糖是一種主要由巖藻糖、半乳糖和甘露糖組成的雜多糖，還含有較高的硫酸根。高分子質量的巖藻聚糖硫酸酯由于分子質量大，結構復雜，難于研究其活性原理和構效關系。而且高分子質量巖藻糖水溶性差，大量服用會明顯延長凝血時間[21]。

本研究采用實驗室制備的中分子質量和低分子質量的巖藻聚糖硫酸酯組分，觀察了巖藻聚糖硫酸酯在體內對氫化可的松所致免疫低下小鼠的作用，發現巖藻聚糖硫酸酯可以顯著增強脾臟的發育，提高小鼠的體液免疫機能如血清溶血素和遲發型變態反應，促進細胞免疫機能如腹腔巨噬細胞吞噬能力。對溶血素的產生和腹腔巨噬細胞吞噬能力的恢復，證明它是一種對T細胞和巨噬細胞有直接作用的免疫調節劑。目前一般認為，免疫活性的增強與腫瘤和病毒免疫監控有密切的關系，巖藻聚糖硫酸酯促進的免疫活性有益于人們進一步研究藥物對腫瘤免疫和病毒免疫的作用。

本實驗比較發現，灌胃不同的分子質量、硫酸根含量和單糖組成的巖藻聚糖硫酸酯在提高免疫低下小鼠的免疫功能方面沒有顯著性差異。經自由基氧化降解得到的低分子質量的巖藻聚糖硫酸酯仍然具有較好的免疫活性，而且易于吸收，食用安全，結構簡單，為以后研究巖藻聚糖硫酸酯活性的構效關系提供參考。

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Immunomodulatory Effect of Fucoidan fromLaminaria japonicain Mice

LI Fang，LI Ba-fang，WANG Jing-feng，ZHANG Jing，LI Yao，ZHAO Xue*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To investigate the effect of fucoidan fromLaminaria japonicaon immune regulation in immunodepressed mice by oral administration. Methods: In this study, different fucoidan fractions were obtained by acid hydrolysis, anion exchange chromatography on Q-Sepharose FF and free radical oxygen degradation and ultrafiltration technology from high molecular weight fucoidan extracted fromLaminaria japonica. The fractions with higher sulfate ester and fucose content on immune regulation were selected by chemical analysis. KM mice were randomly divided into twelve groups: normal control group, model control group, positive group, low dosage (25 mg/(kg·d)), medium dosage (50 mg/(kg·d)) and high dosage (100 mg/(kg·d)) groups of F-2, Fa and Fb fractions, respectively. The immune regulation was investigated by using the model mice in normal and in immunodepression induced by hydrocortisone. Results: The effect on immune function of mice administered with different fucoidan fractions fromLaminaria japonicadid not reveal significant difference. All F-2, Fa and Fb could antagonize the decline of spleen/body weight induced by hydrocortisone, increase hemolysin content (HC50), and promote the ability of macrophages for celiac macrophage. Meanwhile, both F-2 and Fa could improve delayed hypersensitivity level, while Fb had no significant effect on delayed hypersensitivity level. Conclusion: Fucoidan fraction had an excellent effect on immune regulation in immunodepressed mice. However, these fractions did not reveal significant difference in the effect on immune function of mice.

fucoidan；immunodepressed mice；immune regulation

Q946.3；TS218

A

1002-6630(2012)05-0238-05

2011-04-19

國家自然科學基金項目(30800858)；山東省自然科學基金項目(ZR2010CQ020)

李芳(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為海洋生物活性物質。E-mail：lifang8626616@126.com

*通信作者：趙雪(1976—)，女，講師，博士，研究方向為海洋活性物質。E-mail：zhaoxue@ouc.edu.cn