β-酪啡肽-7對大鼠血糖及脂質過氧化的影響

韓東寧，王艷霞，徐晨陽，張源淑*，薛紅霞

(南京農業大學 農業部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

β-酪啡肽-7對大鼠血糖及脂質過氧化的影響

韓東寧，王艷霞，徐晨陽，張源淑*，薛紅霞

(南京農業大學 農業部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

目的：觀察β-酪啡肽-7(β-casomorphin-7，β-CM-7)對糖尿病大鼠的降血糖作用并初步闡明其作用機制。方法：2月齡SD雄性大鼠40只，用鏈脲佐菌素(STZ)致大鼠糖尿病，造模成功后將大鼠分為4個組：空白對照組、糖尿病對照組、胰島素治療組(優泌林 3.7×10-8mol/(只·d))、實驗組(β-CM-7 7.5×10-8mol/(只·d))。實驗周期30d。測定血清中血糖含量、脂質過氧化物丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)的活性、胰島素和胰高血糖素的含量以及腿肌糖原、肝臟糖原的含量。結果：β-CM-7組與胰島素治療組大鼠血糖明顯下降；同時血清中MDA水平降低，SOD活性升高，與糖尿病對照組相比，具有顯著性差異(P＜0.05)；β-CM-7組胰島素含量較糖尿病組有所增加，肌糖原含量較空白組顯著升高(P＜0.05)。結論：β-CM-7具有減輕鏈脲佐菌素性糖尿病大鼠氧自由基損傷、促進胰島素分泌、加速肌糖原的合成、降低血糖的作用。

β-酪啡肽-7；大鼠；血糖；脂質過氧化

乳中含有豐富的營養物質，生理功效較為全面，其基本成分除乳糖和乳脂外，主要為乳蛋白。近年來，人們對乳品化學及營養學的研究發現，牛乳蛋白含有許多具有潛在生物活性物質的前體，在相關酶的作用下可被降解成許多具有生物學功能的小肽。其中阿片活性肽又稱為嗎啡樣活性肽，是研究較早也是較多的一類活性肽。

β-酪啡肽(β-casomorphins，β-CMs)是發現最早的一類具有阿片活性的乳源嗎啡樣活性肽，由β-酪蛋白經酶解產生，其前體的基本序列位于β-酪蛋白的第60～70氨基酸殘基上，結構為NH2-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu-COOH。這一序列在多種動物的乳蛋白中具有保守性[1]，將其進一步水解可得到β-CM-9、β-CM-7、β-CM-6、β-CM-5、β-CM-4等同系物。以往研究發現[2-4]，β-CMs能在動物胃腸道被完整地吸收，產生與內源性阿片肽類似的生理調節功能，如提高外周胰島素和胃泌素的分泌；調節胃腸運動，延長胃腸的排空時間和蠕動時間，促進腸道水分與電解質吸收；影響動物的行為、呼吸、睡眠等。米飯和牛奶同時食用可以降低血糖指標，對于防治糖尿病很有幫助[5]，但降糖作用的有效成分并不明確。宋曉丹等[6]的研究證實β-CM-7體外能夠抑制小腸對葡萄糖的吸收，體內灌胃也具有輔助降血糖作用，但其作用具體機制不詳。本實驗以β-CM-7作用于鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ誘導的糖尿病大鼠，研究β-CM-7對高血糖大鼠血糖和脂質過氧化的影響，探討其可能的降糖機制，為β-酪啡肽的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SD大鼠，2月齡，雄性，購自浙江省實驗動物中心，許可證號SCXF(浙)20080033；標準鼠糧、墊料 青龍山動物繁殖場。

鏈脲佐菌素(STZ) 美國Sigma公司；β-CM-7(序列：Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile，相對分子質量789.42，純度95%，色譜純) 美國鳳凰藥業有限公司；胰島素注射液(優泌林：30%重組人胰島素，70%精蛋白鋅重組人胰島素) 禮來蘇州制藥有限公司；葡萄糖測定試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、肌糖原及肝糖原測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；胰島素及胰高血糖素放射免疫分析藥盒 北京北方生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

怡成血糖儀及怡成虹吸式血糖試紙 北京怡成生物電子有限公司；SCR20BC高速低溫離心機 日本日立公司；FMJ-182放射免疫γ-計數器 上海原子核研究所日環儀器一廠；WH-3微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；BS210S電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；SHA-C型恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；UV-2100型分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 鏈脲佐菌素性糖尿病大鼠模型的建立與分組

雄性SD大鼠40只，體質量150～180g。1周適應期后，隨機留取6只作為正常對照組，其余為模型對照組。模型對照組大鼠禁食不禁水12h后以60mg/kg(以體質量計)一次性腹腔注射STZ溶液。正常對照組(簡稱空白組)注射等體積檸檬酸緩沖液。實驗采用葡萄糖氧化酶法尾靜脈采血，分別在24 、72h后測所有大鼠的空腹血糖水平，以空腹條件下兩次血糖值均≥11.1mmol/L的判定為糖尿病大鼠。

在隨機選取的34只大鼠中，有22只符合模型條件，造模成功率為64.7%，可以進行下一步實驗。

將造模成功大鼠隨機選8只作為糖尿病組，7只胰島素組，7只為β-CM-7組。胰島素組每天皮下注射胰島素6U/只(3.7×10-8mol/(只·d))，β-CM-7組每天腹腔注射β-CM-7溶液7.5×10-8mol/(只·d)，空白組和糖尿病組每天腹腔注射等體積生理鹽水。實驗周期為30d，期間標準鼠糧與飲水不受限制，記錄每天的飲水與采食量；每天稱體質量一次，每5d測空腹血糖一次，實驗末所有大鼠頸靜脈采血后斷頸處死，取血清、心、肝及腿肌等置于－80℃冰箱內冷藏備用。

1.4 生化指標測定

1.4.1 血清中葡萄糖含量測定

采用葡萄糖氧化酶法，按葡萄糖試劑盒說明書操作。

1.4.2 肝臟糖原和腿肌糖原含量測定

按糖原試劑盒說明書操作。稱取60mg左右右腿股內側肌及肝臟，按照1:3(m/V)加堿液后沸水浴20min，流水冷卻；用蒸餾水稀釋成5%肌肉、1%肝臟的糖原檢測液。吸取糖原檢測液100μL加入2mL顯色液，充分混勻后置沸水中煮5min，流水冷卻，于620nm波長處測吸光度，其中腿肌糖原含量是以腿肌組織的質量計，肝臟糖原含量是以肝組織的質量計。

式中：A測定管為測定管吸光度；A標準管為標準管吸光度；c為標準管含量；20為樣本測定前稀釋倍數；100為樣本測定前稀釋倍數。

1.4.3 血清中MDA含量測定

采用TBA比色法；按MDA測定試劑盒說明書操作。在532nm波長處，1cm光徑，蒸餾水調零，測定各管吸光度。

式中：A測定管為測定管吸光度；A測定空白管為測定空白管吸光度；A標準管為標準管吸光度；A標準空白管為標準空白管吸光度；c為標準品濃度；n為樣品測試前稀釋倍數。

1.4.4 血清中總SOD活性測定

采用黃嘌呤氧化酶法，按超氧化物歧化酶測試盒說明書操作。在550nm波長處，1cm光徑，蒸餾水調零測定各管。

式中：A對照管為對照管吸光度；A測定管為測定管吸光度；n1為反應體系稀釋倍數；n2為樣品測試前稀釋倍數。

1.5 胰島素和胰高血糖素含量的測定

按試劑盒說明書操作進行。采用放射免疫γ-計數器讀取各測定管放射性計數，利用線性內插計算方式計算讀取標準曲線求得個測定管胰島素、胰高血糖素含量。胰島素含量結果以每毫升血清中所含胰島素的μIU數計，胰高血糖素含量結果以每毫升血清中含胰高血糖素的皮克(pg)數計。

1.6 數據處理

采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，差異顯著性檢驗采用單因子方差分析(One way ANOVA)中的LSD法。所有數值以±sx－表示。

2 結果與分析

2.1 一般狀況

在大鼠飼養期間，空白組大鼠精神狀況良好、反應靈敏、被毛光滑；胰島素組大鼠精神較好,活動頻繁；糖尿病組大鼠精神萎靡，行動緩慢，皮毛枯燥易脫落，部分趾間有病變，尿量明顯增加，窩內潮濕并且氣味重；β-CM-7組皮膚較糖尿病組光滑，窩內比糖尿病組干燥。

2.2β-CM-7對糖尿病大鼠體質量的影響

圖1 不同組間大鼠體質量的動態變化(±sx，n＝6)Fig.1 Kinetic change of body weights of the rats from each group(±sx，n＝ 6)

由圖1可見，實驗期間空白組與胰島素組大鼠體質量增加明顯；糖尿病組大鼠體質量減輕；β-CM-7組體質量變化介于空白組和糖尿病組之間。

2.3β-CM-7對糖尿病大鼠血糖的影響

由圖2可見，空白組大鼠血糖平穩的維持在正常水平；胰島素組大鼠血糖則比較平整地維持在較低水平，逐漸接近空白組；糖尿病組大鼠血糖明顯升高，一直持續到實驗結束；β-CM-7組大鼠血糖顯著低于糖尿病組，但并未使血糖降至正常水平；表明β-CM-7有緩解血糖升高的作用。

圖2 不同組間大鼠空腹血糖的動態變化(±sx，n＝6)Fig.2 Kinetic change of fasting serum glucose levels of the rats in each group (±sx，n＝ 6)

2.4 大鼠采食及飲水量變化

表1 不同組間大鼠的飲水、采食量變化(±sx，n＝6)Table 1 The change in water consumption and daily food intake of the rats from each group (±sx，n＝ 6)

表1 不同組間大鼠的飲水、采食量變化(±sx，n＝6)Table 1 The change in water consumption and daily food intake of the rats from each group (±sx，n＝ 6)

注：*.與空白組相比，差異顯著(P＜0.05)；#.與糖尿病組相比，差異顯著(P＜0.05)。下同。

組別 平均飲水量/mL 平均采食量/g空白組 34.88±2.23# 28.47±2.13#糖尿病組 143.19±9.35* 33.94±1.35*胰島素組 115.33±8.88*# 37.82±1.79*β-CM-7組 131.41±8.55* 32.64±1.23

由圖1、表1可見，空白組大鼠體質量升高，但采食及飲水均在較低水平；胰島素組飲水量較糖尿病組顯著下降(P＝0.019)；糖尿病組大鼠體質量減輕，采食量顯著高于空白組(P＝0.029)飲水量極顯著高于空白組(P＝0.000)，符合糖尿病“三高一低”的臨床癥狀，模型制造理想。β-CM-7組體質量、采食及飲水情況均介于空白組與糖尿病組之間，表明β-CM-7在一定程度上緩解了糖尿病的發展。

2.5β-CM-7對糖尿病大鼠糖原的影響

表2 不同組間大鼠肝、腿肌糖原含量的變化(±sx，n＝6)Table 2 Effect of β-CM-7 on hepatic and muscular glycogen in diabetic rats (±sx，n＝ 6)

表2 不同組間大鼠肝、腿肌糖原含量的變化(±sx，n＝6)Table 2 Effect of β-CM-7 on hepatic and muscular glycogen in diabetic rats (±sx，n＝ 6)

組別 肝糖原含量/(mg/g) 腿肌糖原含量/(mg/g)空白組 4.376±0.304 0.736±0.053#糖尿病組 2.670±0.197 1.431±0.088*胰島素組 16.444±1.196*# 1.113±0.071*#β-CM-7組 2.657±0.192 1.599±0.062*

由表2可見，在肝糖原的合成上空白組、糖尿病組及β-CM-7組之間沒有明顯差異，胰島素可以顯著提高肝糖原的合成量；在肌糖原合成方面，糖尿病組、胰島素組及β-CM-7組均顯著高于空白組，β-CM-7組肌糖原含量最高，提示β-CM-7具有促進肌糖原合成的作用。

2.6 大鼠血清MDA水平和SOD活性變化

表3 各組大鼠MDA含量和SOD活性變化(±sx，n＝6)Table 3 Effect of β-CM-7 on MDA level and SOD activity in serum of diabetic rats (±sx，n＝ 6)

表3 各組大鼠MDA含量和SOD活性變化(±sx，n＝6)Table 3 Effect of β-CM-7 on MDA level and SOD activity in serum of diabetic rats (±sx，n＝ 6)

組別 MDA含量/(nmol/mL) SOD活性/(U/mL)空白組 6.72±0.21# 131.43±5.50#糖尿病組 11.56±2.87* 83.43±16.89*胰島素組 7.61±0.42# 134.88±9.85#β-CM-7組 6.13±0.28# 131.52±10.82#

由表3可見，空白組大鼠MDA水平較低，同時SOD活性較高；糖尿病組大鼠血清中MDA含量顯著高于其他各組；并且血清中SOD的活性也顯著低于其他各組，表明該組大鼠處于嚴重脂質過氧化狀態，使機體受到損傷。β-CM-7組MDA含量及SOD活性均接近空白組，表明β-CM-7具有明顯提高機體SOD活性，清除氧自由基，抑制脂質過氧化的作用，從而保護機體免受傷害。胰島素也具有與β-CM-7類似的提高機體抗氧化能力的功效。

2.7 大鼠血清胰島素和胰高血糖素含量變化

表4 各組大鼠胰島素和胰高血糖素含量變化(±sx，n＝6)Table 4 Effect of β-CM-7 on serum insulin and glucagon in diabetic rats (±sx，n＝ 6)

表4 各組大鼠胰島素和胰高血糖素含量變化(±sx，n＝6)Table 4 Effect of β-CM-7 on serum insulin and glucagon in diabetic rats (±sx，n＝ 6)

組別 胰島素含量/(μIU/mL) 胰高血糖素含量/(pg/mL)空白組 56.65±3.40# 213.04±16.02糖尿病組 44.82±1.46* 269.98±13.52胰島素組 89.62±5.51*# 303.53±20.60*β-CM-7組 54.57±2.00 345.97±32.09*#

由表4可見，胰島素組胰島素含量最高，顯著高于其他各組；空白組、β-CM-7組及糖尿病組大鼠胰島素含量依次降低。在胰高血糖素含量上，β-CM-7組含量最高，顯著高于空白組與糖尿病組；胰島素組、糖尿病組與空白組中胰高血糖素含量依次下降。

3 討論與結論

大鼠糖尿病模型的制備多采用STZ誘導，其對動物的胰島β細胞具有高度選擇性毒性作用[7]。較大劑量腹腔注射STZ可破壞胰島細胞導致胰島功能衰竭, 血糖明顯升高，可明顯表現出典型1型糖尿病癥狀。在實驗周期30d內，糖尿病組因血糖過高及營養代謝紊亂死亡2只，胰島素注射初期死亡1只。糖尿病組大鼠出現脫毛、多飲、多尿、多食、尿味加重并伴有體質量持續下降，趾間有病變等糖尿病癥狀，表明本研究采用STZ誘導糖尿病大鼠模型可行可靠，效果理想。

酪蛋白是乳中最重要的蛋白成分，含有人體必需的8種氨基酸，是一種全價蛋白質[8]，經蛋白酶分解產生的肽段所具有的潛在生物學活性已受到廣泛重視。酪啡肽是一種最具有代表性的小分子多肽，其中β-CM-7是由酪蛋白酶解所產生的乳源活性肽中重要成員之一，其結構為Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile。有研究證實[9]，β-CM-7對狗的食后胰島素和生長抑素有明顯的外周調控作用；體外研究表明β-CM-7對小腸囊葡萄糖的吸收有一定抑制作用。這些結果提示β-CM-7對糖的代謝可能要一定的調節作用[10]。本實驗在大鼠體內證實β-CM-7具有促進胰島素分泌、促進肌糖原合成緩解血糖升高的作用，結果與Zong Yafeng[11]、宋曉丹[12]、Yin Hong[13]等一致。

體內氧自由基能攻擊生物膜中多聚不飽和脂肪酸，可引起一系列有害的氧化反應，稱為脂質過氧化(lipid peroxidation，LPO)[14]。由此產生一系列脂質過氧化物。MDA是由自由基引發的脂質過氧化作用的最終產物，其含量可間接反映機體的LPO水平。在清除自由基的過程中，抗氧化酶起著重要的作用。抗氧化酶主要有SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞及機體免受傷害。

持續高血糖是引起糖尿病并發癥產生的主要原因。持續的高血糖狀態可在體內產生大量氧自由基，使體內自由基防御機制受損，兩者共同導致氧化應激的加劇[15]，引起組織細胞的過氧化損傷，使靶器官遭到傷害進而導致并發癥的發生[16]。糖尿病的發病與自由基的損傷有密切關系，提示人們采用抗氧化劑治療糖尿病的可能性[17]。本實驗結果顯示，糖尿病大鼠體內脂質MDA含量顯著增高，SOD活性顯著下降，提示大鼠體內脂質過氧化程度顯著增強。β-CM-7可明顯提高機體SOD活性，清除自由基抑制脂質過氧化作用，說明β-CM-7可減輕自由基及其代謝產物對各組織的傷害作用，提示β-CM-7對防治糖尿病及其并發癥方面可以起到重要作用。

本結果顯示β-CM-7對鏈脲佐菌素性糖尿病大鼠具有降血糖功效。提示牛奶及乳制品降解產生的β-CM-7具有降血糖作用，其降血糖作用與其具有促進肌糖原合成加速清除氧自由基、抗脂質過氧化有關。

[1] SCUSDZIARRA V, SCHICK A, de la FUENTE A, et al. Effectof betacasomorphins and analogs on insulin release in dogs[J]. Endocrinology,1983,112(3): 885-889.

[2] ZOGHBIO S, TROMPETTE A, CLAUSTRE J, et al. Beta-casomorphin-7 regulates the secretion and the expression of gastrointestinal mucins through a mu-opioid pathway[J]. Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006, 290(6): 1105-1113.

[3] OHTANI S, OGAWARA K, HIGAKI K, et al. Casein enhancesstability of peptides in intestinal lumen: role of digested products of casein[J].Pharm Res, 2003, 20(11): 1746-1751.

[4] 張源淑, 宗亞峰, 鄒思湘, 等. 仔豬胃腸道食糜和血液中酪啡肽的檢測及阿片樣活性分析[J]. 畜牧獸醫學報, 2006, 37(10): 1063-1066.

[5] KAMINSKI S, CIESLINSKA A, KOSTYRA E. Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health[J]. J Appl Genet,2007, 48(3): 189-198.

[6] 宋曉丹, 任歡歡, 印虹, 等.β-酪啡肽-7對大鼠離體小腸葡萄糖吸收的抑制效應[J]. 營養學報, 2010, 32(2): 117-120.

[7] RAKIETEN N, RAKIETEN M L, NADKAMIM M R. Studies on the diabetogenic action of streptozotocin[J]. Cancer Chemother Rep, 1963,29: 91-98.

[8] 王立暉, 袁永俊, 李培駿, 等. 乳源酪啡肽的研究進展[J]. 食品研究與開發, 2006 , 27(4): 169-171.

[9] READ L C, LORD A P, BRANTL V, et al. Absorption of betacasomorphins from autoperfused lamb and piglet small intestine[J]. Am J Physiol, 1990, 259(3): 443-452.

[10] 宗亞峰.β-酪啡肽在胃腸道內的釋放、吸收和穩定特性及其對胃腸機能的影響[D]. 南京: 南京農業大學, 2007: 104-107.

[11] ZONG Yafeng, CHEN Weihua, ZHANG Yuanshu, et al. Effect of intragastric beta-casomorphin-7 on somatostatin and gastrin gene expression in rat gastric mucosa[J]. Would J Gastroenterol, 2007, 13(14): 2094-2099.

[12] 宋曉丹, 左為勇, 范英蘭, 等. 乳源β-酪啡肽7對大鼠葡萄糖吸收及其機制[J]. 世界華人消化雜志, 2009, 17(19): 1947-1951.

[13] YIN Hong, MIAO Jinfeng, ZHANG Yuanshu. Protective effect ofβcasomorphin-7 in rats with streptozotocin-induced type 1 diabetes[J].Peptide, 2010, 31(9):1725-1729.

[14] JENKINS R R. Free radical chemistry. Relationship to exercise[J].Sport Med, 1988, 5(3): 156-170.

[15] 熊凡, 熊偉, 孫靜. 黃芪對糖尿病大鼠血糖及脂質過氧化作用的影響[J]. 湖北中醫學學報, 2003, 5(2): 20-21.

[16] BAYNES J W. Role of oxidative stress in development of complication in diabetes[J]. Diabetes, 1991, 11(40): 405-412.

[17] 孫冬梅. 人參對糖尿病大鼠的降糖調脂作用[J]. 長春醫學, 2009, 7(1): 1-3.

Effect ofβ-Casomorphin-7 on Blood Glucose Level and Its Anti-lipid Peroxidation Effect in Diabetic Rats

HAN Dong-ning，WANG Yan-xia，XU Chen-yang，ZHANG Yuan-shu*，XUE Hong-xia
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

Objective: To explore the effect ofβ-casomorphin-7 (β-CM-7) on blood glucose and oxidative stress in diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Methods: Forty male SD rats were divided into 4 groups: normal group, diabetic control group, insulin treatment group (administered with humulin at 3.7 × 10-8mol/(day animal)) andβ-CM-7 (7.5 × 10-8mol/(day animal)) treatment group. After administration for 30 consecutive days, all rats were sacrificed and measured for serum glucose level, MDA level, SOD activity and the contents of insulin and glucagons as well as leg muscle glycogen and liver glycogen contents. Results: Theβ-CM-7 treatment and insulin treatment groups revealed a significant decrease in blood glucose level, a reduction in MAD level, and an increase in SOD activity when compared with the diabetic control group (P＜0.05). Theβ-CM-7 treatment group displayed an increase in insulin content when compared with the diabetic control group and a significant increase(P＜0.05) in liver glycogen content when compared with the blank control group. Conclusion:β-CM-7 can reduce free radicalmediated oxidative stress and blood glucose level, promote the secretion of insulin and increase the content of muscular glycogen in diabetic rats thus having hypoglycemic effect.

β-casomorphin-7；rat；blood glucose；lipid peroxidation

R151.3

A

1002-6630(2012)05-0243-05

2011-04-07

國家自然科學基金項目(30871838)

韓東寧(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為乳源生物活性肽。E-mail：2009107030@njau.edu.cn

*通信作者：張源淑(1962—)，女，教授，博士，研究方向為乳源生物活性物質的非營養性功能、肽的生物學。E-mail：zhangyuanshu@njau.edu.cn