柿果多酚對高脂血癥小鼠脂代謝的影響

張倩倩，樊金拴,*，吳敬超，陳 思

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

柿果多酚對高脂血癥小鼠脂代謝的影響

張倩倩1，樊金拴1,*，吳敬超2，陳 思1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

目的：研究柿果多酚調(diào)節(jié)高脂血癥小鼠脂代謝的作用。方法：高脂血癥模型建立成功后，選取雌性昆明小鼠80只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，以正常小鼠為對照A組和B組各10只，對高脂對照組、柿果多酚高、中、低劑量組和辛伐他汀陽性藥物對照組各12只，實(shí)施各口只不同灌胃處理。測定小鼠血清總膽固醇(TC)、血清總甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、肝組織游離脂肪酸(FFA)，以及超氧化物歧化酶(SOD)、脂蛋白酯酶(LPL)、肝酯酶活性(HL)。結(jié)果：柿果多酚能顯著降低高脂血癥小鼠TC、TG、LDL-C、LPO、肝組織FFA(P＜0.01)，對HDL-C提高不顯著，能顯著提高血清SOD及肝組織LPL、HL活性(P＜0.01)。結(jié)論：柿果多酚可通過調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝減輕高脂血癥，預(yù)防動(dòng)脈硬化(AS)。

柿果多酚；高脂血癥；脂代謝；降血脂；動(dòng)脈粥樣硬化

一種或多種血漿脂質(zhì)或脂蛋白異常稱高脂血癥。高脂血癥極易引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)，其中血漿總膽固醇(TC)及氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL-C)濃度升高是誘發(fā)AS的高危因素[1]，AS又可發(fā)展為全身性血管疾病，嚴(yán)重危害人類健康。他汀類藥物作為國際上首選的降血脂藥物，發(fā)揮著巨大的作用[2]。但是由于其對肌肉、肝臟及腎臟有一定的毒害[3]，故探索無毒副作用的天然降脂藥物意義深遠(yuǎn)。

水果多酚具有抗氧化[4]、抗衰老[5]、抗腫瘤、抗誘變[6]、抗動(dòng)脈硬化[7]、抗微生物[8]等作用，且低毒、高效。我國柿資源豐富，且柿果富含多酚類化合物，如沒食子酸、原兒茶酸、丁香酸、香草酸、鞣花酸、原花青素、槲皮素、山萘酚、金絲桃苷、異柿醌等[9-11]。但是，目前國內(nèi)對柿資源的開發(fā)多集中于食品行業(yè)，且利用率低[12]，對柿果多酚的研究也僅限于抗氧化活性方面。本實(shí)驗(yàn)通過建立高脂血癥小鼠模型，探究柿果多酚降血脂機(jī)制。為柿果多酚在降脂藥物及保健品方面的開發(fā)提供理論依據(jù)，以進(jìn)一步擴(kuò)大柿資源的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

SPF級昆明小鼠((19±2)g，雌性)，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

柿果多酚、雌性普通飼料(面粉380g/kg、玉米粉200g/kg、麩皮160g/kg、豆粕150g/kg、魚粉40g/kg、骨粉30g/kg、酵母、食鹽、魚肝油和微量元素添加劑各10g/kg)[13]、高脂飼料(質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%豬油、8.9%蛋黃粉、0.1%膽酸鹽) 本實(shí)驗(yàn)室自制。

血清總膽固醇(TC)試劑盒、血清總甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒 溫州東甌津瑪生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、脂質(zhì)過氧化物(LPO)測試盒、游離脂肪酸(FFA)測試盒、脂蛋白酯酶(LPL)測試盒及肝酯酶(HL)測試盒 南京建成生物工程研究所；膽固醇、膽酸鹽、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；H1650臺式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-3100 紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DZX-6090B真空干燥箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柿果多酚制備

柿果多酚提取：將柿果于100℃水浴煮沸3min，使酶失活。于萬能粉碎機(jī)中攪碎，于－70℃冰箱保存，備用。采用含1% HCl的去離子水，以液料比15:1(V/m)、提取溫度65℃、提取時(shí)間1.5h、旋轉(zhuǎn)水浴提取2次，抽濾所得濾液再以5000r/min離心，得上清，進(jìn)行減壓濃縮，得濃縮液備用。

柿果多酚純化：將pH值保持在6.5，按柿果多酚與ZnSO4質(zhì)量比1:5的比例向以上得到的提取濃縮液中加入沉淀劑ZnSO4，沉淀20min，5000r/min離心10min得沉淀絡(luò)合物，按料酸比1:4 (m/V)加入2mol/L HCl溶液，轉(zhuǎn)溶15min。于5000r/min離心10min，得上清，用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮后真空干燥得精制多酚粉末，經(jīng)Folin-Ciocalteu法測定其純度可達(dá)92.6%。

1.3.2 高脂血癥小鼠模型建立

將雌性昆明小鼠80只于動(dòng)物室飼喂1周，待其完全適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為7組，其中正常對照組A、B各10只，喂普通飼料；高脂對照組、柿果多酚低、中、高劑量組、陽性藥物對照組各12只，喂高脂飼料，早上10：00根據(jù)體質(zhì)量定量喂食，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水。2周后從飼喂高脂飼料的5組小鼠各隨機(jī)取2只，合并為模型組，與正常對照組A一起眼眶后靜脈采血，測定TC、TG、HDL-C、LDL-C含量，以檢測高脂血癥模型是否建立成功。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥

待高脂血癥小鼠模型建立成功后，各組均改喂普通飼料。并于每日早上9：00灌胃，給藥容積0.2mL，連續(xù)給藥4周。正常對照組B、高脂對照組，均灌胃生理鹽水；陽性藥物對照組灌胃辛伐他汀5mg/(kg·d)(以體質(zhì)量計(jì))[13]；柿果多酚高、中、低劑量組分別灌胃20、10、5mg/(kg·d)。

1.3.4 指標(biāo)測定方法

指標(biāo)測定前，實(shí)驗(yàn)小鼠禁食12h，眼眶后靜脈采血，于3500r/min離心15min，分離血清，進(jìn)行TC、TG、HDL-C、LDL-C、LPO、SOD測定。同時(shí)解剖取部分左葉肝臟，勻漿，進(jìn)行FFA、LPL、HL的測定。制漿步驟：將肝組織按肝組織:生理鹽水=1:9(m/V)制成勻漿，3000r/min，離心10min，得上清，待測。以上各指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，高脂模型建立采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，多重比較采用LSD法，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂血癥模型建立

表1 高脂飼料誘導(dǎo)小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量變化(±s，n=10)Table 1 Content changes in serum TC, TG, HDL-C and LDL-C of the mice induced by high fat diet (x ± s，n=10)

表1 高脂飼料誘導(dǎo)小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量變化(±s，n=10)Table 1 Content changes in serum TC, TG, HDL-C and LDL-C of the mice induced by high fat diet (x ± s，n=10)

注：**.與正常對照組A比較，差異極顯著(P＜0.01)。

組別 TC含量/ TG含量/ HDL-C含量/ LDL-C含量/(mmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (mmol/L)正常對照組A 1.474±0.182 0.576±0.047 1.124±0.130 0.489±0.081高脂模型組 4.027±0.338** 1.856±0.041** 1.023±0.087 1.537±0.065**

由表1可知，經(jīng)過連續(xù)2周的造模，高脂模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C顯著高于正常對照組A小鼠的相應(yīng)指標(biāo)，并且差異極顯著(P＜0.01)，雖然血清HDL-C差異不明顯，仍符合高脂血癥模型標(biāo)準(zhǔn)。造模階段對進(jìn)食普通和高脂料的小鼠進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)前者精神飽滿，毛色鮮亮，取食積極，糞便正常。后者精神萎靡，毛色暗淡且毛發(fā)凌亂，食欲減退，糞便糖稀且異味重。綜上所述，小鼠高脂血癥模型建立成功。

表2 柿果多酚對高脂血癥小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of purified persimmon fruit polyphenol on the levels of serum TC, TG, HDL-C and LDL-C of hyperlipidemia mice (±s，n=10)

表2 柿果多酚對高脂血癥小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of purified persimmon fruit polyphenol on the levels of serum TC, TG, HDL-C and LDL-C of hyperlipidemia mice (±s，n=10)

注：*.與正常對照組B比較，差異顯著(P＜0.05)；**.與正常對照組B比較，差異極顯著(P＜0.01)；#.與高脂對照組比較，差異顯著(P＜0.05)；##.與高脂對照組比較，差異極顯著(P＜0.01)。下同。

組別 TC含量/(mmol/L) TG含量/(mmol/L) HDL-C含量/(mmol/L) LDL-C含量/(mmol/L)正常對照組B 1.611±0.646 0.517±0.043 1.322±0.018 0.518±0.057高脂對照組 3.373±0.067** 1.836±0.063** 1.237±0.117 1.608±0.025**陽性藥物對照組 1.579±0.014## 0.524±0.174## 1.319±0.014 0.525±0.042##低劑量組 1.822±0.014**## 0.867±0.020**## 1.325±0.012 0.826±0.087**##柿果多酚 中劑量組 1.715±0.016**## 0.750±0.007**## 1.323±0.014 0.683±0.026**##高劑量組 1.610±0.023## 0.564±0.121## 1.317±0.019 0.520±0.049##

2.2 柿果多酚對小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)給藥4周后，藥物各組小鼠精神狀態(tài)有著不同程度的緩解，柿果多酚各劑量組小鼠行動(dòng)日漸靈活，毛發(fā)越發(fā)整潔，食欲由不佳到旺盛，糞便色深；陽性藥物對照組小鼠輕微嗜睡，偶見行動(dòng)無力，食欲、糞便逐漸恢復(fù)正常。

由表2可知，高劑量柿果多酚及辛伐他汀能顯著降低高脂血癥小鼠血清TC、TG、LDL-C含量，與高脂對照組形成極顯著差異(P＜0.01)，并達(dá)到與正常對照組B無顯著差異；隨著柿果多酚劑量減少，血清中TC、TG、LDL-C的作用效果也越差，且與正常對照組B及高脂對照組均形成極顯著差異(P＜0.01)。說明柿果多酚中、低劑量無法將此3項(xiàng)指標(biāo)降至正常水平，但相對于高脂對照組，各指標(biāo)已有明顯降低。由此可見，柿果多酚對高脂血癥小鼠血清TC、TG、LDL-C含量的降低作用存在量效關(guān)系，即隨著多酚劑量減少，療效降低。各藥物組均可微量升高高脂血癥小鼠HDL-C含量，且柿果多酚劑量越低，效果越好，但均不顯著。

2.3 柿果多酚對小鼠血清LPO、SOD水平的影響

表3 柿果多酚對高脂血癥小鼠血清LPO、SOD水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of purified persimmon fruit polyphenol on the levels of serum LPO and SOD of hyperlipidemia mice (x ± s，n=10)

表3 柿果多酚對高脂血癥小鼠血清LPO、SOD水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of purified persimmon fruit polyphenol on the levels of serum LPO and SOD of hyperlipidemia mice (x ± s，n=10)

組別 LPO含量/(mmol/L) SOD活力/(U/mL)正常對照組B 2.612±0.973 251.622±9.389高脂對照組 4.317±0.289** 101.072±3.999**陽性藥物對照組 3.515±0.133**## 243.806±7.621**##低劑量組 4.197±0.167**## 252.528±2.582##柿果多酚 中劑量組 3.559±0.060**## 315.989±3.952**##高劑量組 2.495±0.144## 428.554±1.026**##

由表3可知，柿果多酚各劑量組及陽性藥物對照組LPO含量與高脂對照組均成極顯著差異(P＜0.01)，只有柿果多酚高劑量組與正常對照組B的LPO含量無顯著差異，其他各組均與正常對照組B有極顯著差異(P＜0.01)。說明各劑量柿果多酚與辛伐他汀均顯著可降低高脂血癥小鼠血清中LPO含量，高劑量柿果多酚效果最優(yōu)，可將LPO基本降至正常水平；隨多酚劑量減小，療效降低。各藥物組與高脂對照組SOD活性差異極顯著(P＜0.01)，柿果多酚低劑量組與正常對照組B的SOD活性無顯著差異，其余各組均有極顯著差異(P＜0.01)。可推知，各劑量柿果多酚及辛伐他汀均能顯著升高脂血癥小鼠SOD活性，其中高劑量組療效最好，其SOD活性近兩倍于正常對照組B，中劑量組SOD活性也顯著高于正常對照組B，而辛伐他汀相對于各劑量柿果多酚效果最差，未能將SOD活性提高到正常水平。

2.4 柿果多酚對小鼠肝組織FFA、LPL及HL水平的影響

表4 柿果多酚對高脂血癥小鼠肝組織FFA、LPL及HL水平的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of purified persimmon fruit polyphenol on the levels of hepatic FFA, LPL and HL of hyperlipidemia mice(±s，n=10)

表4 柿果多酚對高脂血癥小鼠肝組織FFA、LPL及HL水平的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of purified persimmon fruit polyphenol on the levels of hepatic FFA, LPL and HL of hyperlipidemia mice(±s，n=10)

組別 FFA含量/(μmol/g pro) LPL活力/(U/g pro)HL活力/(U/g pro)正常對照組B 82.422±2.020 3.164±0.266 2.833±0.565高脂對照組 397.335±9.699** 1.294±0.048** 1.162±0.162**陽性藥物對照組 392.161±3.6924** 1.360±0.032** 1.232±0.061**低劑量組 207.263±2.689**## 1.843±0.039**##1.626±0.045**##柿果多酚 中劑量組 146.715±3.210**## 2.257±0.038**##2.261±0.091**##高劑量組 136.703±0.745**## 2.560±0.059**## 2.680±0.027##

由表4可知，柿果多酚各劑量組FFA、LPL水平與正常對照組B及高脂對照組均成極顯著差異(P＜0.01)；陽性藥物對照組FFA、LPL水平與正常對照組B成極顯著差異(P＜0.01)，與高脂對照組差異不顯著。說明柿果多酚可顯著降低高脂血癥小鼠肝組織FFA含量、升高LPL活性，但最終指標(biāo)并未達(dá)到正常水平，隨柿果多酚劑量降低，效果減弱；而辛伐他汀有降低肝組織FFA含量及升高LPL活性的傾向，但不顯著。柿果多酚各劑量組HL活性與高脂對照組存在極顯著差異(P＜0.01)，其中高劑量組與正常對照組B無顯著差異；陽性藥物對照組HL活性與高脂對照組差異不顯著，與正常對照組B成極顯著差異(P＜0.01)。可推知，各劑量柿果多酚均可顯著升高高脂血癥小鼠HL活性，且劑量越高，效果越好，高劑量柿果多酚可將HL活性升高到基本正常水平；而辛伐他汀可略升高HL活性，效果不顯著。

3 討 論

柿子在中國有著藥食兩用的悠久歷史，在國外也被長期認(rèn)為是保健水果。Gorinstein等[14]認(rèn)為柿比蘋果更能防止冠狀動(dòng)及脈腦動(dòng)脈栓塞，Achiwa等[6]斷柿果中的某成分能有效抑制LDL的氧化，故降低人類換AS的風(fēng)險(xiǎn)。有實(shí)驗(yàn)對此功能性成分進(jìn)行探索，推斷柿果多酚能顯著降低高膽固醇膳食大鼠血清TC、TG、LDL-C含量，提高HDL-C含量[15]。本實(shí)驗(yàn)以高純度柿果多酚為材料，并以傳統(tǒng)降血脂藥物辛伐他汀為對照，研究其對高血脂癥的療效，探索可能的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：柿果多酚能降低高脂血癥小鼠血清 TC、TG、LDL-C，LPO，緩解高脂血癥癥狀，預(yù)防AS；降低肝組織FFA，提高血清SOD、肝總酯酶(LPL及HL)活性，調(diào)節(jié)脂循環(huán)紊亂，保護(hù)肝細(xì)胞。

醫(yī)學(xué)資料表明，細(xì)胞內(nèi)TC升高引起LDL基因表達(dá)受阻，LDL受體合成抑制，從而引起血漿LDL及TC水平升高[16]。體內(nèi)高TG促進(jìn)不易被氧化的A型LDL轉(zhuǎn)化為極易被氧化的B型LDL，Ox-LDL主要來源于氧化的B型LDL[17]。Witztun等[18]認(rèn)為高量LDL及氧化的B型LDL是AS發(fā)生的關(guān)鍵因素。HDL-C能抑制LDL-C氧化[19]，其濃度與AS發(fā)生成負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，柿果多酚未能顯著升高HDL-C，與已有報(bào)道不符，原因可能是實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，效果不顯著，或者是柿果多酚不能顯著提高處于正常范圍內(nèi)的HDL-C，亦或?qū)嶒?yàn)存在誤差，需要后續(xù)研究證明。LPO可氧化LDL，而體內(nèi)SOD等抗氧化酶系統(tǒng)可降低LPO的氧化作用。高血脂常導(dǎo)致FFA升高，從而使活性氧簇、活性氮簇激增，這些高活性分子可氧化蛋白質(zhì)、DNA、脂類等，并且嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞[20]。LPL是脂肪細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，主要分解與蛋白質(zhì)結(jié)合的TG，促進(jìn)膽固醇在脂蛋白之間轉(zhuǎn)移，其功能異常可導(dǎo)致高TG的發(fā)生。HL由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，水解TG及磷脂，參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、乳糜微粒(chylomicron，CM)殘骸及LDL的代謝及HDL-C的重構(gòu)。LPL、HL活力異常與AS存在較高相關(guān)性[21]。LPL及HL活性的恢復(fù)和增加促進(jìn)TC、TG的下調(diào)及HDL-C的上調(diào)，有效調(diào)節(jié)脂代謝紊亂。

綜上所述，柿果多酚可能通過激活抗氧化酶系統(tǒng)如SOD以及總酯酶LPL、HL活性，最終提高機(jī)體抗氧化能力，減少LPO、FFA對機(jī)體損傷，降低LDL-C被氧化的可能性，降低TC、TG及LDL-C各項(xiàng)指標(biāo)，達(dá)到治療高脂血癥目標(biāo)，預(yù)防AS發(fā)生。柿果多酚是純天然物質(zhì)，無毒副作用，可望開發(fā)為降脂藥物及保健品，不僅可造福人類，亦為提高柿資源綜合利用價(jià)值提供理論依據(jù)。

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Effect of Persimmon Fruit Polyphenol on Lipid Metabolism of Hyperlipidemia Mice

ZHANG Qian-qian1，F(xiàn)AN Jin-shuan1,*，WU Jing-chao2，CHEN Si1
(1. College of Forestry, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；
2. College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Objective: To explore the effect of persimmon fruit polyphenol on lipid metabolism of hyperlipidemia mice. Methods:Totally 80 mice were divided into 7 groups including normal control group A and B, high blood fat group, persimmon fruit polyphenol groups at high, middle and low dosages and positive control group were treated with different supplementations after the hyperlipidemia mouse model had been established through high fat diet. Levels of serum total cholesterol (TC), total triglycerides (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), lipid peroxides(LPO), hepatic free fatty acid (FFA), superoxide dismutase (SOD), lipoprotein lipase (LPL) and hepatic lipase (HL) in mice were evaluated. Results: Persimmon fruit polyphenol could remarkably reduce the levels of serum TC, TG, LDL-C, LPO and hepatic FFA (P＜0.01), slightly increase the level of HDL-C and notably improve the activities of SOD, LPL and HL(P＜0.01). Conclusion: Persimmon fruit polyphenol could alleviate hyperlipidemia by regulating lipid metabolism of mice, thus preventing arteriosclerosis(AS).

persimmon fruit polyphenol；hyperlipidemia；lipid metabolism；plasma lipid reduction；arteriosclerosis

R151.2

A

1002-6630(2012)05-0252-04

2011-04-13

國家林業(yè)局中美國際合作基金項(xiàng)目(WH0629)

張倩倩(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)利用。E-mail：sophia.taylor6868@hotmail.com

*通信作者：樊金拴(1958—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)利用。E-mail：fanjinshuan@163.com