扇貝性腺多糖提取物的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性

宋蓀陽，孫黎明,*，朱蓓薇，牛海玲，楊靜峰

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國家貝類加工技術(shù)研究分中心，遼寧 大連 116034)

扇貝性腺多糖提取物的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性

宋蓀陽1,2，孫黎明1,2,*，朱蓓薇1,2，牛海玲1,2，楊靜峰1,2

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.國家貝類加工技術(shù)研究分中心，遼寧 大連 116034)

通過酶解法制備扇貝性腺多糖提取物(SGP)，研究其抗體外氧化及免疫調(diào)節(jié)活性。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH體系反應(yīng)、Fenton反應(yīng)和還原反應(yīng)測定SGP的抗氧化活性；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測定SGP 對活性氧叔丁基脂氫過氧化物(tBOOH)致細胞氧化損傷及淋巴細胞增殖活性的調(diào)節(jié)作用；分光光度法測定SGP 對補體活性的影響。結(jié)果表明：SGP具有DPPH自由基清除能力(IC50=9.92mg/mL)和羥自由基清除能力(IC50=7.31mg/mL)及還原能力(AC20=7.74mg/mL)；0.2μg/mL的SGP可明顯改善tBOOH致RAW264.7細胞的氧化損傷作用，還可顯著提高脾淋巴細胞的增殖活性及補體經(jīng)典途徑活性。

扇貝性腺；多糖提取物；抗氧化；淋巴細胞增殖；補體

蝦夷扇貝是一種重要的海珍品，其中閉殼肌為主要可食部分，而其他部分如裙邊、內(nèi)臟、性腺等大部分被丟棄。多糖是存在于貝類體內(nèi)的一種活性物質(zhì)[1-4]。近年來，研究報道表明從扇貝廢棄物中提取的多糖具有廣泛的生理活性。王長云等[5]從海灣扇貝邊中提取出的氨基多糖具有抗凝血活性。殷紅玲等[6]從扇貝內(nèi)臟中提取多糖，具有羥自由基清除能力。金曉石等[7]從華貴櫛孔扇貝全臟器中提取糖胺聚糖，能夠顯著抑制HeLa細胞的生長。目前，有關(guān)扇貝性腺多糖提取物的研究尚未見報道。

本實驗以蝦夷扇貝性腺為原料，制備扇貝性腺多糖提取物，并對其清除DPPH自由基、清除羥自由基、還原能力和對叔丁基脂氫過氧化物(tBOOH)致細胞氧化損傷的保護作用等抗氧化活性進行研究。同時探討扇貝性腺多糖提取物對淋巴細胞增殖和補體活性的影響，以期為扇貝的深加工及扇貝功能食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蝦夷扇貝，由大連獐子島漁業(yè)集團股份有限公司提供。

胃蛋白酶 杭州中香化學(xué)有限公司；木瓜蛋白酶上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；堿性蛋白酶 北京東華強盛生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶 Sanland-chem International 公司；胰蛋白酶 美國Amresco公司；鏈霉蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LG-1.0型真空冷凍干燥機 沈陽航天新陽速凍設(shè)備制造有限公司；UV-2100紫外分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；Bio-Rad 680酶標儀 美國Bio-Rad公司；倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司。

1.3 實驗動物及供試細胞

昆明種小鼠，18～20g，雌性，由大連醫(yī)科大學(xué)提供。

RAW264.7細胞(ATCCTIB-71) 上海細胞研究所；綿羊紅細胞(SRBC) 大連醫(yī)科大學(xué)。

1.4.4 對羥自由基的清除能力

1.4 方法

1.4.1 扇貝性腺多糖提取物的制備

從新鮮蝦夷扇貝中取出性腺，清洗，經(jīng)真空冷凍干燥機干燥48h，使其水分質(zhì)量分數(shù)控制在8%(以100g干物質(zhì)計)以下，粉碎，過20目篩，得扇貝性腺凍干粉，備用。

取扇貝性腺凍干粉，加入25倍體積水攪拌均勻，預(yù)煮20min，并超聲30min。用6mol/L HCl溶液調(diào)pH值到2.0，加入質(zhì)量分數(shù)2.5%的胃蛋白酶，37℃水浴2.5h，煮沸滅酶10min。冷卻至室溫后，用6mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至中性，離心10min，取上清。加入3倍體積95%乙醇，醇沉1 2 h，取沉淀，水溶沉淀，離心、收集上清液，濃縮、凍干。

所得凍干樣品再經(jīng)堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶依次酶解，條件分別按表1進行。之后醇沉12h，離心收集上清，濃縮、凍干。

表1 蛋白酶的水解條件Table 1 Parameters for enzymatic hydrolysis

將上述酶解樣品凍融離心后配成5g/100mL的樣品溶液。按酶與蛋白質(zhì)量比1:50的比例加入鏈霉蛋白酶，37℃水浴保溫24h，之后醇沉12h，濃縮，透析，凍干，即得扇貝性腺多糖提取物(scallop gonad polysaccharide，SGP)。

1.4.2 SGP組分測定

多糖測定：采用苯酚-硫酸法；蛋白質(zhì)測定：采用Folin-酚法；硫酸根測定：采用明膠比濁；氨基己糖、氨基半乳糖測定：采用氨基比色法；糖醛酸測定：采用比色法[8]。1.4.3 對DPPH自由基的清除能力

在0.1mL不同質(zhì)量濃度的SGP溶液中加入0.2mL 0.1mmol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液和0.2mL 0.2mmol/L DPPH溶液(用9 5%乙醇配制)，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30min。于波長517nm處測定吸光度A1。同時用95%乙醇代替DPPH溶液測定吸光度A2，用去離子水代替樣品測定吸光度A0，VC為陽性對照[9]。

按順序分別取0.25mL 0.75mmol/L的鄰菲羅啉，0.25mL 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)，0.25mL SGP溶液，充分混勻后，再加入0.25mL FeSO4(0.75mmol/L)和 0.1mL H2O2(0.1mL/L)啟動反應(yīng)，于37℃水浴保溫60min，在波長536nm處測OD值。空白組以等體積的去離子水代替SGP，對照組以等體積的去離子水代替SGP和H2O2，用VC作陽性對照[9]。

1.4.5 還原能力測定

取0.2mL不同質(zhì)量濃度SGP溶液，加入0.1mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液0.2mL和1g/100mL鐵氰化鉀溶液0.1mL，混勻，50℃保溫20min，再加入10g/100mL三氯乙酸溶液0.1mL，振蕩混勻，4000r/min離心10min。取上清液0.25mL，加入0.25mL去離子水和0.05mL 0.1% FeCl3溶液，靜置10min后于波長700nm處比色。用去離子水做空白對照，VC為陽性對照[9]。

1.4.6 對tBOOH致細胞氧化損傷的保護作用

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為5×104個/mL。96孔培養(yǎng)板中每孔加入180μL細胞，再加20μL SGP溶液(終質(zhì)量濃度分別為0.2、1、5μg/mL)；正常對照組和tBOOH對照組加相應(yīng)體積的生理鹽水；每組5個平行；于37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，除正常對照組，其他每組各孔再加入5μL tBOOH，終濃度為8×10-5mol/L；繼續(xù)培養(yǎng)2h后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT，繼續(xù)孵育4h。離心，棄上清，加入150μL DMSO溶解甲瓚。用酶標儀于波長570nm處測OD值。

1.4.7 對淋巴細胞增殖活性的影響

無菌制備小鼠脾臟細胞。在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔添加180μL脾細胞懸液，細胞數(shù)為5×106個/mL，再加入10μL的SGP溶液(終質(zhì)量濃度分別為0.2、1、5μg/mL)，于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。生理鹽水為對照。MTT比色法測定同1.4.6節(jié)。

1.4.8 對補體激活經(jīng)典途徑活性的影響

取脫纖維綿羊紅細胞(SRBC)用緩沖液GGVB(0.141mol/L NaCl、0.5mmol/L MgCl2、0.15mmol/L CaCl2、1.8mmol/L 巴比妥鈉、0.1%明膠，pH7.4)離心洗3次，2000r/min，離心10min。制備體積分數(shù)2%的SRBC樣品，加入等體積1:4000稀釋的溶血素，混勻后置37℃水浴30min，即為致敏的SRBC。于10μL SGP溶液中加入200μL補體(人血清，1:25稀釋)和200μL GGVB，37℃水浴30min，加入100μL致敏SRBC，37℃水浴30min，4000r/min離心10min，于波長405nm處測上清液OD值。用10μL GGVB代替樣品作為空白對照。

1.4.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 SGP的制備及其組合分析

表2 SGP的組分分析Table 2 Component analysis of SGP

經(jīng)過多種蛋白酶處理及醇沉后制備得到SGP，其各組分如表2所示。多糖、氨基己糖和氨基半乳糖質(zhì)量分數(shù)分別為50.10%、12.83%和3.73%，構(gòu)成SGP的糖鏈部分。此外，SGP還含有一定量的蛋白質(zhì)、硫酸根和糖醛酸，說明SGP是一種氨基硫酸酯多糖-蛋白復(fù)合物。

2.2 SGP的自由基清除能力及還原能力

在SGP質(zhì)量濃度2.5～20mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH自由基的清除率從22.9%升至86.3%，清除能力與濃度具有明顯的效應(yīng)-劑量關(guān)系，IC50值為9.92mg/mL。同時，還原能力也隨SGP質(zhì)量濃度增大逐漸增大(表3)，根據(jù)線性回歸方程計算得出AC20值(吸光度為0.2時的樣品質(zhì)量濃度)為7.74mg/mL。質(zhì)量濃度為2～10mg/mL的 SGP對羥自由基的清除率從15.9%升至65.4%，IC50值為7.31mg/mL(圖 1)。

表3 SGP對DPPH自由基的清除能力及還原能力(±s，n=10)Table 3 Scavenging effect of SGP on DPPH free radicals and its reducing power (x ± s，n=10)

表3 SGP對DPPH自由基的清除能力及還原能力(±s，n=10)Table 3 Scavenging effect of SGP on DPPH free radicals and its reducing power (x ± s，n=10)

SGP質(zhì)量濃度/(mg/mL)DPPH自由基清除能力/% 還原能力(OD700nm)2.5 22.9±2.1 0.073±0.0027 5 31.1±2.9 0.141±0.0037 10 51.9±2.3 0.255±0.0055 15 68.4±4.1 0.375±0.0046 20 86.3±3.8 0.469±0.0046

圖1 SGP對羥自由基清除能力的影響(±s，n=10)Fig.1 Scavenging effect of SGP on hydroxyl free radicals± s，n=10)

2.3 SGP對RAW264.7細胞氧化損傷的保護作用

表4 SGP對tBOOH導(dǎo)致的氧化損傷細胞的保護作用(± s，n=10)Table 4 Protective effect of SGP on tBOOH-induced cell oxidation(± s，n=10)

表4 SGP對tBOOH導(dǎo)致的氧化損傷細胞的保護作用(± s，n=10)Table 4 Protective effect of SGP on tBOOH-induced cell oxidation(± s，n=10)

注：##.與正常對照組比較，有極顯著差異(P＜0.01)；*.與tBOOH組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與tBOOH組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 對氧化損傷的保護作用(OD570nm)正常對照組 0.981±0.015 tBOOH對照組 0.654±0.010##0.2 0.669±0.003*SGP質(zhì)量濃度/(μg/mL) 1 0.712±0.002**5 0.735±0.010**

由表4可見，與正常對照組比較，tBOOH的加入可導(dǎo)致RAW264.7細胞活力明顯下降，說明tBOOH可造成細胞嚴重的氧化損傷。加入終質(zhì)量濃度為0.2、1、5μg/mL 的SGP后，RAW264.7細胞的活力均得到顯著提高。結(jié)果表明，SGP能夠提高細胞的抗氧化能力，從而抵抗氧化劑tBOOH的損傷作用。

2.4 SGP對淋巴細胞增殖活性的影響

由表5可見，當SGP質(zhì)量濃度分別為0.2、1、5μg/mL時，隨著其質(zhì)量濃度的增大，對淋巴細胞增殖的促進作用也逐漸增強，且作用非常顯著。

表5 SGP的免疫活性(±s，n=10)Table 5 Immune activity of SGP (x ± s，n=10)

表5 SGP的免疫活性(±s，n=10)Table 5 Immune activity of SGP (x ± s，n=10)

注：*.與空白對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與空白對照組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 淋巴細胞增殖 淋巴細胞 補體活性 補體激活性(OD570nm) 增殖指數(shù) (OD405nm) 活率/%空白對照組 0.942±0.012 0.859±0.025 SGP 0.2 0.979±0.009* 1.04±0.005 0.933±0.025** 8.64±2.1質(zhì)量濃度/ 1 1.04±0.028** 1.10±0.028 1.067±0.021** 24.12±0.5(μg/mL) 5 1.13±0.010** 1.20±0.022 1.22±0.0053** 42.19±2.5

2.5 SGP對補體經(jīng)典途徑活性的影響

表5顯示，SGP對人補體的經(jīng)典途徑活性具有顯著的激活作用，呈現(xiàn)一定劑量-效應(yīng)關(guān)系，當SGP質(zhì)量濃度為5μg/mL 時，補體激活率達到42.19%。

3 結(jié) 論

扇貝性腺中蛋白質(zhì)含量很高(占干質(zhì)量的68.53%)，因此制備SGP的關(guān)鍵就是去除蛋白質(zhì)。本實驗采用多種蛋白酶聯(lián)合酶解的方法制備得到SGP，其蛋白含量僅為14.43%，說明該酶解方案可有效去除蛋白質(zhì)。由于多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)可能影響多糖復(fù)合物的生物活性，因此，本實驗沒有采取其他更為劇烈的方法進一步除去蛋白質(zhì)[10]。具有一定的蛋白質(zhì)，這也是動物多糖不同于植物多糖的重要特點之一。

自由基生成過多，嚴重危害人體健康，很多疾病過程都與自由基代謝相關(guān)[11]。因此，自由基的生成控制一直是研究的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)，SGP能夠清除DPPH自由基和羥自由基，且具有一定的還原能力。同時，SGP還能夠降低tBOOH對RAW264.7細胞造成的氧化損傷，對氧化損傷具有一定的保護和防御作用。SGP的抗氧化能力與其具有多羥基結(jié)構(gòu)和糖醛酸結(jié)構(gòu)有關(guān)。

淋巴細胞是參與機體免疫應(yīng)答的重要細胞，其增殖能力關(guān)系到應(yīng)答水平及免疫能力的強弱。本實驗結(jié)果表明，較低質(zhì)量濃度的SGP(0.2μg/mL)可明顯促進淋巴細胞的增殖活性，提示SGP對細胞免疫功能具有潛在的增強作用。補體是人體正常的免疫防御系統(tǒng)之一，主要包括經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑[12]。研究發(fā)現(xiàn)，SGP能夠激活補體的經(jīng)典途徑，這種激活作用可能與其結(jié)構(gòu)中的硫酸根、糖醛酸和少量氨基半乳糖有關(guān)[13]。SGP對旁路途徑及凝集素途徑的影響還有待進一步研究。

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Antioxidant and Immunomodulating Activities of Polysaccharide from Scallop Gonad

SONG Sun-yang1,2，SUN Li-ming1,2,*，ZHU Bei-wei1,2，NIU Hai-ling1,2，YANG Jing-feng1,2
(1. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2. National R&D Branch Center for Shellfish Processing, Dalian 116034, China)

Scallop gonad polysaccharide extract (SGP) was obtained by hydrolysis with a series of commercial enzymes. Its antioxidant activity was evaluated by DPPH system, Fenton system and reduction reaction. MTT assay was used to evaluate its effect on tBOOH-induced oxidative damage and lymphocyte proliferation. The effect on complement activity was evaluated by spectrophotometry. The results indicated that SGP had reducing power and scavenging effect on DPPH and hydroxyl free radicals. SGP at the 0.2μg/mL could also protect RAW264.7 cells from oxidative damage induced by tBOOH. Moreover, SGP could also promote lymphocyte proliferation and activate complement activity.

scallop gonad；polysaccharide extracts；antioxidant；lymphocyte proliferation；complement

TS254.9

A

1002-6630(2012)05-0248-04

2011-03-10

“十一五” 國家科技支撐計劃項目(2008BAD94B07)；遼寧省重點實驗室建設(shè)項目(2008403003)；遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊計劃項目(2009T033；2008T007)

宋蓀陽(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品深加工。E-mail：ssy80904@126.com

孫黎明(1974—)，女，副教授，博士，研究方向為海洋活性天然產(chǎn)物。E-mail：sunlm@dicp.ac.cn