桂枝甘草湯對心陽虛心動過緩大鼠竇房結Gsα蛋白含量的影響

馮善濤，李立煌，任 利

（福建中醫藥大學 藥學院，福建 福州 350108）

桂枝甘草湯出自張仲景《傷寒論》，是溫心陽，養心氣的祖方。方中以桂枝辛甘發散溫通心陽，以炙甘草甘緩補虛溫養心氣［1，2］。原書用于治療“發汗過多，其人叉手自冒汗，心下悸欲得按者”，現臨床多用于治療緩慢性心律失常，文獻報道效果肯定［3-6］。本實驗旨在通過復制心陽虛心動過緩大鼠模型，觀察桂枝甘草湯對試驗大鼠心率的影響，并通過檢測試驗大鼠Gsα蛋白含量，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 儀器

生理儀，BL-420，成都泰盟科技有限公司；BIOFUGE全能臺式高速冷凍離心機；酶標儀，Bio-Tek ELX800光吸收；電泳儀、半干法轉膜儀、化學發光成像儀，BIO-RAD。

1.2 藥品與試劑

普萘洛爾片，陜西云鵬制藥有限公司，批號B 080901；心寶丸，廣東省藥物研究所制藥廠；桂枝、甘草，購自福建省藥材公司，經鑒定桂枝為正品；生理鹽水，福州海王福藥制藥有限公司，批號090822A04；細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒、Tubulin抗體、山羊抗小鼠IgG均購自碧云天生物技術研究所；Gsα蛋白抗體，美國abcam 公司，編號ab83735；羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司，編號ZDR-5306。

1.3 實驗動物

SPF級SD大鼠60只，體重（200±20）g，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；普通飼料，福建中醫藥大學動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組

實驗動物雌、雄分籠，適應性飼養1周后，分別隨機分為空白組（K）、模型組（普萘洛爾90mg·kg-1）（M）、心寶對照組（劑量83mg·kg-1）（X）、和桂枝甘草湯高劑量組（2.4g·kg-1）（G）、中劑量組（1.2g·kg-1）（Z）、低劑量組（0.6g·kg-1）（D）。除空白組外，各組大鼠上午灌胃普萘洛爾（90mg·kg-1），下午分別灌胃生理鹽水、心寶和各劑量的桂枝甘草湯，1次／d，連續7天。

2.2 一般體征檢測

設定大鼠便狀、扎堆、毛皮、神態、卷曲拱背、尾涼、體重、反應靈敏度8項體征評價指標，視各項指標對心陽虛診斷意義相同，每項指標，按輕重程度分為Ⅰ級1分、Ⅱ級2分、Ⅲ級3分。設每項指標7日總平均值為其終值，8項指標終值相加得累積分。設心陽虛程度為Y值，累積分為L值，Y＝L／8。給藥期間，每日給藥前專人觀察評價各項指標并記錄。

2.3 心率檢測

于灌胃結束當日始，禁食24h，除桂枝甘草湯組及心寶組分別灌胃對應劑量藥物，其它組灌胃生理鹽水，2h后，10%水合氯醛3mL·kg-1腹腔注射麻醉，生理儀測各鼠心電圖，持續5min，記錄各鼠心率。

2.4 竇房結Gsα蛋白含量測定

于心臟界嵴部靜脈竇側、前腔靜脈根部，取100mg的心肌組織塊，參照細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒使用說明抽取膜蛋白，Bradford法定量蛋白濃度；參照凝膠配置試劑盒使用說明配制10%分離膠，5%濃縮膠；按照每4μL蛋白樣品加入1μL蛋白上樣緩沖液（5X）的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液（5X）。100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后，直接上樣到SDSPAGE膠加樣孔內即可。以PBS和5X蛋白上樣緩沖液調配蛋白樣本濃度為10μg·μL-1，100℃加熱10min，按照每4微升蛋白樣品加入1微升蛋白上樣緩沖液（5X）的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液（5X）。100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后，直接上樣到SDSPAGE膠加樣孔內即可。冷卻至室溫后；每個樣本平行上樣兩塊膠（樣本膠與復本膠），每塊膠上樣♀K、♀G、♀Z、♀D、♀M或♂K、♂G、♂Z、♂D、♂M，每孔上樣10μL；80V、20min濃縮，100V、60min分離；樣本膠與復本膠均15V、45min半干法轉膜；封閉液（含5%脫脂奶粉，0.5%Tween-TBS）室溫非特異性封閉2h；樣本膜加Gsα蛋白抗體（按滴度1：100稀釋）復本膜加Tubulin抗體（按滴度1：1000稀釋），4℃過夜；0.5%Tween-TBS清洗2次，TBS清洗一次；分別加入羊抗兔IgG（按滴度1：10000稀釋）、山羊抗小鼠IgG（按滴度1：1000稀釋）室溫孵2h；0.5%Tween-TBS清洗2次，TBS清洗1次；加ECL試劑，化學發光成像儀ChemiDoc XRS系統成像，Quantity One圖像分析軟件分析各蛋白條帶灰度。

3 實驗結果

3.1 桂枝甘草湯對實驗大鼠一般體征的影響

表1 實驗大鼠一般體征統計 （m±s）

如表1所示，模型組大鼠心陽虛程度明顯高于空白組；桂枝甘草湯各劑量組大鼠心陽虛程度均明顯低于模型組；中、高劑量桂枝甘草湯組大鼠心陽虛程度與空白組比較無明顯差異。

3.2 桂枝甘草湯對實驗大鼠心率的影響

如表2所示，模型組大鼠心率明顯低于空白組；桂枝甘草湯各劑量組大鼠心率均明顯高于模型組；中、高劑量桂枝甘草湯組大鼠心率與空白組、心寶組比較均無明顯差異。

3.3 桂枝甘草湯對實驗大鼠竇房結Gsα蛋白表達的影響

如表3所示，模型組大鼠竇房結Gsα蛋白含量明顯低于空白組，各劑量桂枝甘草湯組大鼠竇房結Gsα蛋白含量均明顯高于模型組，低劑量桂枝甘草湯組大鼠竇房結Gsα蛋白含量與空白組無明顯差異性，中、高劑量桂枝甘草湯組大鼠竇房結Gsα蛋白含量明顯高于空白組。

表2 實驗大鼠心率 （次／min，m±s）

表3 實驗大鼠竇房結Gsα蛋白含量 （%）

圖1 實驗大鼠竇房結Gsα蛋白

圖2 實驗大鼠竇房結復本膠內參Tubulin

4 討論

竇房結Gsα蛋白含量的高低對起搏細胞離子通道蛋白活性及心率的調控具有重要的作用。Gsα蛋白，即刺激性鳥苷酸結合調節蛋白，是細胞內一類重要的信號傳導蛋白。作為耦聯與細胞表面受體和細胞內效應器的橋梁，是調節心臟功能的主要因素［7］。在竇房結神經血管內皮細胞受體-腺苷酸環化酶（AC）信號傳導系統中，G蛋白以Gαβγ復合體的形式與受體和作為效應器的起搏細胞離子通道蛋白共同定位在細胞膜上。當交感神經興奮時，腎上腺激素受體被激活，并與Gαβγ復合體相互作用，使Gsα亞基游離；游離的Gsα蛋白介導PKA（cAMP依賴蛋白激酶）激活，促進cAMP的合成，并通過cAMP介導HCN（環核苷酸門控）、Cav1、K等離子通道磷酸化，增加通道活性，增加If、ICa-L、IK等；進而引發動作各相電位變化、竇房結自律性和激動能力提高等一系列心率正性效應［8］。

實驗結果顯示，桂枝甘草湯能明顯提高心動過緩大鼠的心率，對正常大鼠心率無明顯影響，作為心臟功能調節主要因素的Gsα蛋白隨桂枝甘草湯劑量增加持續增加，桂枝甘草湯對大鼠竇房結Gsα蛋白含量的調節是其治療心動過緩的機制之一。

［1］王秋，王占石.桂枝甘草湯溫經通脈的藥效學研究［J］.中醫藥研究，2002，18（5）：41-42.

［2］呂英，高潔.桂枝甘草湯“辛甘化陽”配伍的實驗研究［J］.中藥材，2010，33（8）：1297-1299.

［3］洪麗生，劉長節.桂枝甘草湯加減治療心血管疾病療效觀察［J］.福建醫藥雜志，2006，27（2）：149-150.

［4］黃海.試論經方的雙向調節作用［J］.江西中醫學院學報，2000，12（1）：26-27.

［5］黃海.桂枝甘草湯加減治療心血管病［J］.中醫雜志，2005，46（1）：71.

［6］郭翠萍.淺談桂枝湯類方的雙向調節作用［J］.中國醫藥衛生，2005，6（17）：121-122.

［7］周元國，王正國，朱佩.G蛋白在心臟功能調節中的作用蛋白在心血管功能調節及急性肺損傷中的作用研究［J］.第三軍醫大學報，1997（2）：159-162.

［8］齊普斯（美），賈萊夫（美）.郭繼鴻，李學斌，譯.心臟電生理：從細胞到臨床［M］.北京：北京大學醫學出版社，2008.