大孔吸附樹脂分離純化齒葉白鵑梅葉中的總黃酮

王靈芝，劉玉強，才 謙

（遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600）

齒葉白鵑梅（Exochorda serratifolia S.Moore.）是薔薇科繡線菊亞科白鵑梅屬植物［1］。白鵑梅屬分為白鵑梅和齒葉白鵑梅兩個種，其中白鵑梅主要生長在我國的江蘇、浙江、安徽一帶，以其根皮、樹皮入藥，用于腰膝酸痛的治療［2］；齒葉白鵑梅主要生長在遼寧凌源、喀左等地區及河北一帶，其花蕾和幼葉可食用，并且作為民間偏方來預防和治療糖尿病。本課題組從齒葉白鵑梅葉中分離得到多個黃酮化合物［3］，為進一步研究，對總黃酮進行富集。本文采用靜態吸附法及吸附動力學試驗對7種大孔吸附樹脂進行篩選，并優選純化工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-3010型紫外分光光度計（日本島津）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司）；sartorius CP225D型電子天平（十萬分之一，德國sartorius公司）；恒溫水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；DFT型藥用萬能粉碎機（溫嶺市大得中藥機械有限公司生產）。

1.2 試藥

乙醇（分析純，天津科密歐化學試劑有限公司）；大孔樹脂 HPD600，HPD100，DM130，HPD826，AB-8，D101，HPD400（滄州寶恩大孔樹脂有限公司）。實驗用齒葉白鵑梅葉：采于遼寧省朝陽市凌源縣，由遼寧中醫藥大學王冰教授鑒定為齒葉白鵑梅（Exochorda serratifolia S.Moore.）葉；蘆丁對照品（自制，純度為98%以上）。

2 方法與結果

2.1 樹脂型號的考查

2.1.1 樹脂的預處理

無水乙醇充分浸泡24h后用乙醇洗至洗出液加適量水時無白色混濁現象，然后用去離子水洗盡醇，再用5%的鹽酸浸泡3h后用去離子水洗至中性后5%氫化鈉溶液浸泡3h，同樣洗至中性，濾去水溶液，烘干備用。

2.1.2 樹脂靜態吸附篩選實驗

（1）靜態吸附量及吸附率的測定。

將7種不同型號的樹脂分別按上述方法預處理，各取3g精密稱定，分別置于帶磨口塞的三角瓶中，精密加入齒葉白鵑梅葉的提取液15mL（總黃酮濃度為2.7mg·mL-1），充分振搖，靜置24h后，抽濾，測定濾液中總黃酮濃度。計算各樹脂室溫下的吸附量及吸附率：

其中：E為吸附率，C0起始濃度（mg·mL-1），Cr為濾液濃度（mg·mL-1），Q 為吸附量（mg·g-1），V 為溶液體積（mL），W 為樹脂重量（g）。

（2）靜態解吸率的測定。

收集（1）中濾出濾液的飽和樹脂，精密加入95%乙醇20mL進行解吸，充分振搖，靜置24h，濾過得解吸液，測定總黃酮濃度。計算解吸率（%）：

解吸率（%）＝（解吸液濃度×解吸液體積）／樹脂的飽和吸附量×100%

結果見表1。

根據上述吸附率和解析率結果可以看出D101樹脂對齒葉白鵑梅葉總黃酮的吸附量和解吸率適中。因此，選擇D101樹脂進行總黃酮的富集純化。

表1 7種樹脂對齒葉白鵑梅葉總黃酮的靜態吸附-解吸附考察結果 （n＝3）

2.2 D101型大孔吸附樹脂純化齒葉白鵑梅葉總黃酮的工藝參數優選

2.2.1 最佳上樣濃度的確定

將不同濃度的齒葉白鵑梅葉樣品溶液（總黃酮的上樣量一致），分別通過裝有相同量D101型大孔樹脂的層析柱（1BV＝20mL）進行動態吸附［4］。考察樹脂對不同濃度上樣液中總黃酮吸附差別。待吸附完全后以3BV水洗脫，3.5 BV 95%乙醇解吸，收集解吸液，測定總黃酮回收率，確定最佳上樣濃度。從結果可知，大孔樹脂對齒葉白鵑梅葉總黃酮的吸附隨濃度的變化而變化，齒葉白鵑梅葉總黃酮的回收率在上樣濃度為2mg·mL-1時最高。因此，確定齒葉白鵑梅葉提取物上樣液總黃酮的濃度為2.0mg·mL-1＼。

2.2.2 泄漏曲線的繪制

將不同體積總黃酮的濃度為2.0mg·mL-1的齒葉白鵑梅葉樣品液通過D101大孔樹脂的玻璃柱（1BV＝20mL）進行動態吸附，分部收集洗脫液，測定每份收集液總黃酮含量，計算未吸附率，為了總黃酮保留完全，設定未吸附率15%為泄漏點，從結果可知，上樣量為30mL時，未吸附率開始明顯增大，說明樹脂柱此時不能完全吸附樣品液中的總黃酮。據此確定30mL（1.5BV）作為最大上樣量。

2.2.3 洗脫溶劑的篩選

按上述確定的吸附條件進行動態吸附后，用3BV水洗去未吸附成分后，分別用3.5BV的30%，50%，70%，90%的乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮的含量，計算總黃酮回收率。結果見表2。

表2 不同濃度乙醇洗脫劑洗脫結果 （n＝3）

由表2可知，90%乙醇洗脫的總黃酮的回收率最高，因此選擇90%乙醇為齒葉白鵑梅葉總黃酮的洗脫劑。

2.2.4 洗脫曲線的繪制

按上述確定的吸附條件和洗脫條件，取齒葉白鵑梅葉樣品液進行上柱、吸附和洗脫，分段收集洗脫液。每5mL收集1份，共收集27份，計算每份洗脫液中總黃酮濃度，從結果得知，當洗脫液用量為90mL（4.5BV）時，洗脫液中總黃酮含量幾乎為零，說明樹脂柱上吸附的總黃酮已基本洗脫完全。因此，洗脫劑用量為4.5倍樹脂床體積。

2.3 D101大孔吸附樹脂純化齒葉白鵑梅葉總黃酮工藝的驗證

取三批齒葉白鵑梅葉樣品液各30mL分別按上述確定的吸附、洗脫條件進行上柱、吸附和洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮含量，計算總黃酮回收率及純度。結果見表3。

表3 D101樹脂純化齒葉白鵑梅葉總黃酮的工藝驗證結果

由表3看出，經D101大孔樹脂處理后的齒葉白鵑梅葉總黃酮回收率大于95%，平均純度為59.44%，RSD＝1.91%，具有良好的重現性。

3 結論

通過靜態吸附-解吸試驗，從7種大孔吸附樹脂中篩選出D101型大孔樹脂最適合齒葉白鵑梅葉總黃酮的富集。通過動態吸附-洗脫試驗，D101型大孔樹脂富集齒葉白鵑梅葉總黃酮的工藝條件為：上樣溶液中總黃酮的濃度以2.5 mg·mL-1為宜，最大上樣量為1.5倍樹脂床體積，洗脫溶劑為90%乙醇，洗脫劑用量為4.5倍樹脂床體積，可得總黃酮質量分數為59.10%的齒葉白鵑梅葉提取物粉末。

［1］傅沛云.東北植物檢索表［M］.北京：科學出版社，1995：283-284.

［2］中國藥材公司.中國中藥資源志要［M］.北京：科學出版社，1994：508.

［3］才謙，王聰，劉玉強.齒葉白鵑梅葉中黃酮類成分的分離與結構鑒定［J］.沈陽藥科大學學報，2011，28（3）：190-191.

［4］才謙，劉濤，付玉芹，等.大孔吸附樹脂法富集龍膽中裂環烯醚萜苷類成分的實驗研究［J］.中成藥，2003，25（4）：271-172.